Introducción. El síndrome de Hunter o mucopolisacaridosis tipo II (MC KUSIK 309900) es causado por la deficiencia de la iduronato 2-sulfato sulfatasa humana (E.C. 3.1.6.13). La enzima no ha sido cristalizada y por tanto sus estructuras no se conocen por deducción experimental. Objetivo. Proponer un modelo computacional para la estructura tridimensional de la iduronato 2-sulfato sulfatasa humana. Materiales y métodos. Se realizó un análisis computacional de esta enzima empleando programas de libre acceso en internet como Comput pI/MW, JaMBW Chapter 3.1.7, SWISS-MODEL, 3D-PSSM, ProSup. Los procesos de minimización de energía se realizaron con el programa Discover 3 del paquete Insight II (2004). Resultados. Se propone un modelo tridimensional de la iduronato 2-sulfato sulfatasa humana que presenta 33,3% en hélice, 7,2% en hoja plegada y 59,5% en enrollamiento al azar (coil). Se hallaron valores de RMS (del inglés Root Mean Square) de 0,78 y 0,86Å al compararla con otras enzimas de la misma familia. El modelo revela cinco sitios potenciales de N-glicosilación y una entrada al bolsillo que contiene los aminoácidos que componen el sitio activo. Usando este modelo se encontró una buena correlación entre el tipo de mutaciones y la gravedad de la enfermedad en 20 pacientes analizados. Conclusión. Los valores de RMS y la correlación genotipo-fenotipo en los pacientes analizados sugieren el modelo puede usarse para predecir ciertos aspectos del comportamiento biológico de la enzima. Palabras clave: mucopolisacaridosis II, iduronato sulfatasa, estructura terciaria de proteína, metodologías computacionales. Computational prediction of the tertiary structure of the human iduronate 2-sulfate sulfatase Introduction. Hunter syndrome (MC KUSIK 309900) or mucopolysacharidosis type II is due to the deficiency of the enzyme iduronate 2 sulfate sulfatase (E.C. 3.1.6.13). This enzyme has not been crystallized, and therefore the experimental structures are not available. Objectives. A computational three-dimensional model was proposed for the iduronate 2 sulfate sulfatase enzyme. Materials and methods. A computational analysis of this enzyme used the following free internet software programs: Comput pI/MW, JaMBW Chapter 3.1.7, SWISS-MODEL, Geno3d, ProSup. Energy minimization was done with Discover 3 and Insight II version 2004. Results. A three-dimensional conformational model was proposed. The model showed 33.3% of helix structure, 7.2% beta sheet, and 59.5% random coil. RMS values (Root Mean Square) (0.78 and 0.86Å) were found when compared with other enzymes of the same family. The model presented 5 exposed N-glycosylation potential sites and an entry to the pocket that
En la búsqueda de alternativas para mejorar la expresión de la enzima Iduronato Sulfatasa (IDSh) en la levadura Pichia pastoris, se realizó una Revisión Sistemática de la Literatura con el fin de recopilar información que permitiera relacionar los niveles de expresión de proteínas humanas recombinantes con la señal de secreción y las características propias de la molécula a expresar. Se hallaron 349 publicaciones de las cuales sólo 7 (2%) reportaron la expresión de proteínas que cumplían con los criterios de inclusión manejados en el estudio. Con la información obtenida en los 7 artículos se realizó una prueba de hipótesis tomando como muestras los datos recopilados y un análisis cualitativo de la información, con los cuales se evidenció que al reemplazar la señal de secreción nativa por el a-Factor como péptido líder se incrementa el nivel de expresión de proteínas humanas recombinantes en P. pastoris (p=0.053). Se encontró que la eliminación de la secuencia que codifica para el péptido nativo heterólogo en el ADNc de la proteína, es imprescindible para que el a-Factor pueda favorecer la secreción de proteínas heterólogas y por consiguiente incrementar el nivel de expresión. En el caso de la IDShr se halló que en la construcción GS115/pPIC9-IDS, aparecen dos secuencias de péptido señal al mismo tiempo, la nativa de la IDSh y la putativa proveniente de Saccharomyces cerevisiae; sin embargo, se han obtenidos expresiones hasta de ~30mmol/h mg de proteína, lo que deja la incógnita de un posible conflicto en el reconocimiento erróneo de una u otra señal de secreción, teniendo en cuenta el grado de hidrofobicidad de ambas.
* Los dos autores contribuyeron igualmente para este trabajo.Introducción. La enfermedad de Hunter es un trastorno lisosómico caracterizado por la deficiencia de la enzima iduronato-2-sulfato sulfatasa (IDS) (EC 3.1.6.13). Esta enfermedad, al igual que muchos trastornos metabólicos, son patologías intratables mediante la terapéutica convencional; sin embargo, existe la posibilidad de ser tratada alternativamente mediante terapia génica o terapia de reemplazo enzimático. Objetivo. El Instituto de Errores Innatos del Metabolismo (IEIM) ha desarrollado un sistema de expresión de sulfatasas para producir IDS humana recombinante (IDShr) en Escherichia coli y Pichia pastoris, con resultados favorables. El objetivo principal de este trabajo fue desarrollar un sistema de detección de IDS humana recombinante. Materiales y métodos. Para el efecto, se inmunizaron con IDS comercial de TKT (Cambridge, MA) dos conejos de raza Nueva Zelanda blanca y los anticuerpos purificados a partir del suero se utilizaron en el desarrollo de una técnica semicuantitativa por dot-blot. Diferentes muestras de extractos crudos de fermentaciones con P. pastoris y E. coli se procesaron con el fin de poder determinar la presencia de la enzima. Resultados. Se demostró que los anticuerpos eran específicos en el reconocimiento de la IDS sin presentar reactividad cruzada con proteínas contaminantes de los extractos crudos. Conclusión. Por consiguiente, los anticuerpos se podrán usar en el desarrollo de una técnica ELISA tipo sandwich como método de detección y cuantificación de la enzima y en procesos de purificación de la misma mediante cromatografía de afinidad.Palabras clave: mucopolisacaridosis I, iduronato sulfatasa, síndrome de Hunter, terapia de reemplazo enzimático, anticuerpos policlonales, dot-blot, anticuerpos policlonales.Production of polyclonal antibodies to protein iduronate-2-sulphate sulphatase (IDS) and development of a detection system for human recombinant IDS Introduction. Hunter syndrome is a lysosomal disorder characterized by iduronate 2-sulphate sulphatase (IDS) genetic deficiency. Although MPS type II (Hunter) has no cure, enzyme replacement therapy (ERT) and gene therapy are potential new approaches to treatment. Objective. The Institute for the Study of Innate Errors of Metabolism is currently developing a sulphatase expression system through human recombinant IDS (hrIDS) in Pichia pastoris and Escherichia coli. Material and methods. A monitoring method for IDS was developed by production of polyclonal antibodies from rabbit against human IDS. Two New Zealand white rabbits were immunized with commercial IDS. These antibodies were used in a dot-blot method for detection and partial quantification of human recombinant IDS. P. pastoris and E. coli fermentation crude extracts were processed to determine IDS presence. Results. The antibodies were demonstrably IDS specific, without cross reaction with crude extract contaminant proteins. Conclusion. Therefore, these antibodies can be used to establish an ELISA sandwich system as ...
ResumenLa levadura Pichia pastoris constituye un excelente modelo para la expresión de proteínas heterólogas, lo que se refleja en el gran número de proteínas que han sido obtenidas en este modelo biológico, bajo el control del promotor AOX1. Esto implica que el número de peroxisomas y la enzima alcohol oxidasa es regulada como respuesta a la inducción por metabolitos como el metanol, el glicerol, el etanol, el acetato y vías metabólicas como la b-oxidación. En esta revisión, se discuten aspectos relacionados con el metabolismo de estos compuestos y su posible influencia en la producción de proteínas recombinantes, específicamente la Iduronato 2-sulfato sulfatasa humana (IDSh).Palabras clave: Pichia pastoris, AOX, represión catabólica, autofagia, fuente de carbono, peroxisoma AbstractInfluence of carbon source over the expression of AOX1-regulated proteins in Pichia pastoris: The Pichia pastoris yeast is an excellent model for the expression of heterologous protein, thus could be deduce from the greate number of proteins that has been obtain in this biological model under the control of AOX1 promoter. This means that peroxisomes number and the enzyme alcohol oxidase are regulate as response to the induction of different metabolites such as methanol, glycerol, ethanol, acetate and metabolic pathways like the boxidation. In this review, aspects related with the metabolism of this compounds and its possible influence in the production of recombinant proteins are discuss, specifically the human Iduronate 2-sulfate sulfatase (hIDS).
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