Key pointsr Mice with Ca 2+ -calmodulin-dependent protein kinase (CaMKII) constitutive pseudo-phosphorylation of the ryanodine receptor RyR2 at Ser2814 (S2814D +/+ mice) exhibit a higher open probability of RyR2, higher sarcoplasmic reticulum (SR) Ca 2+ leak in diastole and increased propensity to arrhythmias under stress conditions. r We generated phospholamban (PLN)-deficient S2814D r A mathematical human myocyte model replicates these results and predicts the increase in SR Ca 2+ uptake required to prevent the arrhythmias induced by a CaMKII-dependent leaky RyR2.Abstract Mice with constitutive pseudo-phosphorylation at Ser2814-RyR2 (S2814D +/+ ) have increased propensity to arrhythmias under β-adrenergic stress conditions. Although abnormal Ca 2+ release from the sarcoplasmic reticulum (SR) has been linked to arrhythmogenesis, the role played by SR Ca 2+ uptake remains controversial. We tested the hypothesis that an increase in SR Ca 2+ uptake is able to rescue the increased arrhythmia propensity of S2814D +/+ mice. We generated phospholamban (PLN)-deficient/S2814D +/+ knock-in mice by crossing two colonies, S2814D

Abnormal intracellular Ca2+ cycling plays a key role in cardiac dysfunction, particularly during the setting of ischemia/reperfusion (I/R). During ischemia there is an increase in cytosolic and sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+. At the onset of reperfusion there is a transient and abrupt increase in cytosolic Ca2+ which occurs timely associated with reperfusion arrhythmias. However, little is known about the subcellular dynamics of Ca2+ increase during I/R and a possible role of the SR as a mechanism underlying this increase has been previously overlooked. The aim of the present work is to test two main hypotheses: 1. An increase in the frequency of diastolic Ca2+ sparks (cspf) constitutes a mayor substrate for the ischemia-induced diastolic Ca2+ increase; 2. An increase in cytosolic Ca2+ pro-arrhythmogenic events (Ca2+ waves), mediates the abrupt diastolic Ca2+ rise at the onset of reperfusion. We used confocal microscopy on mouse intact hearts loaded with Fluo-4. Hearts were submitted to global I/R (12/30 min) to assess epicardial Ca2+ sparks in the whole heart. Intact heart sparks were faster than in isolated myocytes whereas cspf was not different. During ischemia, cspf significantly increased relative to preischemia (2.07±0.33 vs. 1.13±0.20 sp/sec/100μm, n=29/34, 7 hearts). Reperfusion significantly changed Ca2+ sparks kinetics, by prolonging Ca2+ sparks rise time and decreased cspf. However it significantly increased Ca2+ wave frequency relative to ischemia (0.71±0.14 vs. 0.38±0.06 w/sec/100μm, n=32/33, 7 hearts). The results show for the first time the assessment of intact perfused heart Ca2+ sparks and provides direct evidence of increased Ca2+ sparks in ischemia that transform into Ca2+ waves during reperfusion. These waves may constitute a main trigger of reperfusion arrhythmias.

Our results demonstrate that increasing SR Ca2+ uptake by PLN ablation can prevent the arrhythmic events triggered by CaMKII-dependent phosphorylation of RyR2-induced-SR Ca2+ leak. These findings underscore the benefits of increasing SERCA2a activity in the face of SR Ca2+ triggered arrhythmias. However, enhanced SERCA2a cannot prevent but rather exacerbates I/R cardiac injury.

Background and Purpose Despite the importance of mitochondrial Ca2+ to metabolic regulation and cell physiology, little is known about the mechanisms that regulate Ca2+ entry into the mitochondria. Accordingly, we established a system to determine the role of the mitochondrial Ca2+ uniporter in an isolated heart model, at baseline and during increased workload following β‐adrenoceptor stimulation. Experimental Approach Cardiac contractility, oxygen consumption and intracellular Ca2+ transients were measured in ex vivo perfused murine hearts. Ru360 and spermine were used to modify mitochondrial Ca2+ uniporter activity. Changes in mitochondrial Ca2+ content and energetic phosphate metabolite levels were determined. Key Results The addition of Ru360, a selective inhibitor of the mitochondrial Ca2+ uniporter, induced progressively and sustained negative inotropic effects that were dose‐dependent with an EC50 of 7 μM. Treatment with spermine, a uniporter agonist, showed a positive inotropic effect that was blocked by Ru360. Inotropic stimulation with isoprenaline elevated oxygen consumption (2.7‐fold), Ca2+‐dependent activation of pyruvate dehydrogenase (5‐fold) and mitochondrial Ca2+ content (2.5‐fold). However, in Ru360‐treated hearts, this parameter was attenuated. In addition, β‐adrenoceptor stimulation in the presence of Ru360 did not affect intracellular Ca2+ handling, PKA or Ca2+/calmodulin‐dependent PK signalling. Conclusions and Implications Inhibition of the mitochondrial Ca2+ uniporter decreases β‐adrenoceptor response, uncoupling between workload and production of energetic metabolites. Our results support the hypothesis that the coupling of workload and energy supply is partly dependent on mitochondrial Ca2+ uniporter activity.

La disfunción mecánica y las arritmias son dos hechos característicos de la insuficiencia cardíaca (IC), una causa principal de morbimortalidad a nivel mundial (Cleland y col., 2002; Mozaffarian y col., 2007; Benjamin y col.,2017). Actualmente se conoce que el mal manejo del calcio(Ca2+) es una causa principal de esas dos alteraciones típicas de la IC(Hasenfuss y col., 2002; Pogwizd y col., 2004; Luo y col., 2013). Es sabido además que una fracción importante de las arritmias ventriculares de la IC se inician a nivel celular por mecanismos disparados focalmente, tales como las descargas espontáneas y anormales de Ca2+ desde el retículo sarcoplasmático (RS), que se propagan como ondas de Ca2+ regenerativas a través de las células cardíacas (Cowling y col., 2013). Las ondas espontáneas de Ca2+ son arritmogénicas debido a que activan corrientes de membrana despolarizantes, fundamentalmente a través del intercambiador electrogénico Na+/Ca2+ (NCX) trabajando en su modo directo (Pogwizd y col., 2004; Laurita y col., 2008; Luo y col., 2013). Un aumento de la pérdida de Ca2+por el RS (Ca2+leak) se produce en condiciones en las que la carga del RS excede un umbral que está principalmente determinado por el estado particular de los receptores de rianodina o canales liberadores de Ca2+ del RS (RyR2). Por ejemplo, mutaciones puntuales de los RyR2 hacen que estos canales se vuelvan más proclives a la pérdida espontánea de Ca2+ por el RS, frente a un estímulo adrenérgico. Los pacientes que padecen esta anomalía hereditaria exhiben taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgica (CPVT), una causa conocida de muerte súbita (Liu y col., 2008). La fosforilación del RyR2 mediada por la proteína quinasa dependiente de Ca2+-calmodulina II (CaMKII) en el residuo Ser2814 del RyR2, se ha asociado con un aumento de la pérdida de Ca2+ por el RS y con arritmogénesis en patologías cardíacas de diferente etiología (Ai y col., 2005; Chelu y col., 2009; Gonano y col., 2011; Said y col., 2008, 2011). La CaMKII está sobreexpresada y más activa en la IC y diversas evidencias experimentales indican que la fosforilación del RyR2 en el sitio Ser2814 constituye el principal mecanismo de arritmias en esta enfermedad (Ai y col., 2005). Estos resultados sugieren un rol crucial de la alteración de la actividad de los RyR2 en las arritmias disparadas por Ca2+. En contraste, el efecto de aumentar la recaptura de Ca2+ por el RS sobre este tipo de eventos es poco claro y hay preocupación acerca de si el aumento del mismo, que se conoce como una terapéutica útil para revertir la disminución de la contractilidad de la IC al menos en animales (Hajjar y col., 2008), es protector respecto a las arritmias disparadas por Ca2+ o si por el contrario, las exacerba. Esta preocupación tiene soporte experimental debido a que se han obtenido resultados contradictorios de los efectos del aumento de la recaptura de Ca2+ en distintos tipos de arritmias, en algunos casos beneficiosos (Davia y col., 2001; del Monte y col., 2004; Prunier y col., 2008;Bai y col., 2013) y en otros perjudiciales(Lukyanenko y col., 1999; Landgraf y col., 2004; Stokke y col., 2010; Liu y col., 2015). Estos datos indican que el efecto del aumento dela recaptura de Ca2+ por el RS sobre las arritmias disparadas por Ca2+ no es claro y que se necesitan estudios orientados a esclarecer este efecto y la causa de las discordancias previas. El presente Trabajo de Tesis se propone estudiar el efecto del aumento de la recaptura de Ca2+ por el RS cardíaco sobre la propensión a arritmias por estrés y por reperfusión que produce la fosforilación mediada por CaMKII del sitio Ser2814 del RyR2. A manera de introducción y para una mejor comprensión del tema y de los conceptos vertidos precedentemente, explicaremos en primer lugar, los diferentes pasos y procesos que forman parte del acoplamiento excito-contráctil (AEC) en el músculo cardíaco. Luego se detallará la función de las proteínas que intervienen en el AEC y su regulación. Por último se describirá la generación de arritmias en el corazón, específicamente las que ocurren por estrés y durante la reperfusión luego de un período de isquemia.