Durante o resfriamento de sêmen canino, o contato do plasma seminal por longo período com os espermatozoides pode afetar negativamente a composição da membrana plasmática e reduzir a capacidade de fecundação. A centrifugação para remoção do plasma também pode ter influência negativa sobre célula espermática, devido a danos celulares físicos, remoção de fatores inibidores da capacitação e aumento na produção de radicais livres. Diante disso, o objetivo deste trabalho foi avaliar a influência da remoção de plasma seminal por centrifugação na qualidade de sêmen canino submetido a resfriamento. Foram coletados 19 ejaculados de caninos hígidos. Cada ejaculado foi avaliado quanto à qualidade espermática e dividido em dois tratamentos: 1) não-centrifugado: diluição e armazenamento sob resfriamento; 2) centrifugado: diluição, centrifugação a 600 × g por 15 minutos, descarte de sobrenadante, ressuspensão do pellet com diluente e armazenamento sob resfriamento a 5ºC por 48h. As amostras foram avaliadas quanto à motilidade, vigor, integridade de membrana e morfologia, às 24h e 48h de resfriamento. Os dados foram avaliados por estatística descritiva, ANOVA e a comparação entre médias pelo teste de Tukey. Foi verificada diferença significativa (p<0.05) quanto à motilidade às 24h (não-centrifugado 70,2±3,9% e centrifugado 61,9±3,3%); às 48h (59,5±3,9% e 47,6±4,7%, respectivamente) e às 24h quanto a defeitos espermáticos (11,4±0,7% e 14,7±1,2%, respectivamente). Como resultado, as amostras de sêmen canino não submetidas à remoção do plasma seminal por centrifugação apresentaram maior média de motilidade e morfologia normal durante o resfriamento a 5ºC por 48h.