The production of extracellular xylanase, beta-xylosidase and alpha-l-arabinofuranosidase by the mesophilic fungus Penicillium janczewskii under submerged cultivation was investigated with different carbon sources. Optimization steps included studies of carbon source concentration, temperature of cultivation and initial pH of culture medium. The production of these enzymes was increased two times when cultures were supplemented with brewer's spent grain at 2% concentration, pH 6.0 and carried out at 25 degrees C. Under these optimized conditions were obtained xylanase activity of 15.19UmL(-1) and 23.54Umgprot(-1), beta-xylosidase activity of 0.16UmL(-1) and 0.25Umgprot(-1) and alpha-l-arabinofuranosidase activity of 0.67UmL(-1) and 1.04Umgprot(-1). Brewer's spent grain is a promising substrate for P. janczewskii growth and xylanolytic enzyme production, since it is the main by-product from the brewing industry, available in large amounts and at low-cost in many countries.
BackgroundSecond-generation ethanol production is a clean bioenergy source with potential to mitigate fossil fuel emissions. The engineering of Saccharomyces cerevisiae for xylose utilization is an essential step towards the production of this biofuel. Though xylose isomerase (XI) is the key enzyme for xylose conversion, almost half of the XI genes are not functional when expressed in S. cerevisiae. To date, protein misfolding is the most plausible hypothesis to explain this phenomenon.ResultsThis study demonstrated that XI from the bacterium Propionibacterium acidipropionici becomes functional in S. cerevisiae when co-expressed with GroEL-GroES chaperonin complex from Escherichia coli. The developed strain BTY34, harboring the chaperonin complex, is able to efficiently convert xylose to ethanol with a yield of 0.44 g ethanol/g xylose. Furthermore, the BTY34 strain presents a xylose consumption rate similar to those observed for strains carrying the widely used XI from the fungus Orpinomyces sp. In addition, the tetrameric XI structure from P. acidipropionici showed an elevated number of hydrophobic amino acid residues on the surface of protein when compared to XI commonly expressed in S. cerevisiae.ConclusionsBased on our results, we elaborate an extensive discussion concerning the uncertainties that surround heterologous expression of xylose isomerases in S. cerevisiae. Probably, a correct folding promoted by GroEL-GroES could solve some issues regarding a limited or absent XI activity in S. cerevisiae. The strains developed in this work have promising industrial characteristics, and the designed strategy could be an interesting approach to overcome the non-functionality of bacterial protein expression in yeasts.Electronic supplementary materialThe online version of this article (10.1186/s12896-017-0389-7) contains supplementary material, which is available to authorized users.
The highest production of α-L-arabinofuranosidase by Penicillium janczewskii in medium with brewer's spent grain and orange waste was observed when cultivation was carried out in pH 5.0 at 25°C, for 8.5 days under shaking. The α-L-arabinofuranosidase present in the crude filtrate was optimally active at 60°C and pH 4.0; it was stable in a wide range of pH, maintaining 90% of the activity from 2.0 to 8.0. The enzyme was very stable at 40°C, maintaining 90% of the activity within 1 h. The estimated half-life at 50°C was 10 min, and at 60 and 70°C, it was 5 min. This enzyme was activated in the presence of Ba 2+ , Ca 2+ , Mn 2+ and NH 4 + while the ions Pb 2+ , Mg 2+ , Hg 2+ , Co 2+ and Cu 2+ , as well as PMSF, DTT, βmercaptoethanol, EDTA and SDS inhibited it.
In this work, we evaluated the fermentative performance and metabolism modifications of a second generation (2G) industrial yeast by comparing an industrial condition during laboratory and industrial scale fermentations. Fermentations were done using industrial lignocellulosic hydrolysate and a synthetic medium containing inhibitors and analyses were carried out through transcriptomics and proteomics of these experimental conditions. We found that fermentation profiles were very similar, but there was an increase in xylose consumption rate during fermentations using synthetic medium when compared to lignocellulosic hydrolysate, likely due to the presence of unknown growth inhibitors contained in the hydrolysate. We also evaluated the bacterial community composition of the industrial fermentation setting and found that the presence of homofermentative and heterofermentative bacteria did not significantly change the performance of yeast fermentation. In parallel, temporal differentially expressed genes (tDEG) showed differences in gene expression profiles between compared conditions, including heat shocks and the presence of up-regulated genes from the TCA cycle during anaerobic xylose fermentation. Thus, we indicate HMF as a possible electron acceptor in this rapid respiratory process performed by yeast, in addition to demonstrating the importance of culture medium for the performance of yeast within industrial fermentation processes, highlighting the uniquenesses according to scales.
Aos meus pais, Marco e Leda Temer, Por ensinarem tudo que eu deveria ser, por mostrarem tudo que eu poderia ser, por deixarem eu ser tudo o que queria ser, por me encorajarem a ser mais do que eu imaginava ser. Amo vocês eterna e incondicionalmente. AGRADECIMENTOSÀ minha família, em especial a minha mãe Leda Temer, meu pai Marco Antônio Temer, in memoriam, a minha irmã Thaís Temer, meu marido Bruno Alves Benite e meus avós Luiz Simões da Cunha e Maria Adelaide Simões da Cunha, por todo o apoio, carinho, atenção, dedicação, paciência e por todo amor, não apenas durante meu mestrado, mas também durante toda a minha vida. Devo à eles tudo que sou hoje, por serem minha inspiração, meu porto seguro, meu amor incondicional, meu tudo.Ao meu orientador, Prof. Dr. Gonçalo Amarante Guimarães Pereira, pela orientação, dedicação e atenção durante os últimos seis anos. Sua energia, sabedoria, motivação e empreendedorismo foram essenciais para meu desenvolvimento acadêmico, pessoal e profissional, de forma que faltam palavras para agradecer pela oportunidade, apoio e paciência.À Eliane Laranja Dias, por todo o apoio, paciência, carinho e dedicação, sempre dispostas a ajudar nos mais diversos assuntos.Aos meus colegas que se tornaram grandes amigos ao longo desses anos: Renata, Karina, Gabriel (Doug) e Gleidson, por todo o apoio e discussões sobre meu trabalho, pela paciência sempre que precisei de ajuda, pela atenção em todos os momentos e, principalmente, pela amizade e companhia nos cafés diários, sempre tornando os meus dias mais agradáveis.Aos meus colegas Marcelo Carazzole e Leandro Santos que compartilharam seu conhecimento comigo tendo papéis essenciais no desenvolvimento do trabalho e no meu desenvolvimento acadêmico e pessoal.À todos os integrantes do Laboratório de Genômica e Expressão (LGE), pela amizade e apoio na realização deste trabalho. por toda ajuda durante esses dois anos e pela companhia divertida que fez com que meus dias fossem mais prazerosos.O presente trabalho foi realizado com apoio da coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior -Brasil (CAPES) -Código de financiamento 001 Obrigada a todos. RESUMOO Brasil é uma das principais potências no campo da produção de biocombustíveis com o bioetanol como seu principal produto. O bioetanol brasileiro é produzido principalmente pela fermentação da cana-de-açúcar e é conhecido como etanol de primeira geração (1G).Recentemente, materiais lignocelulósicos também estão sendo usados como matéria-prima, originando o etanol de segunda geração (2G). O bioetanol é considerado um produto de baixo valor agregado, portanto, baixos custos de produção são essenciais para que seja economicamente viável. Considerando os processos 1G e 2G, várias etapas e condições ainda podem ser aprimoradas. Na produção de etanol 1G, por exemplo, muitas vezes é detectada a presença de micro-organismos indesejáveis que levam a perdas severas e, em alguns casos, ao fechamento temporário da usina. Atualmente, a principal estratégia adotada para superar esse problema é o uso profil...
vi vii RESUMOUm dos principais desafios a serem superados para que a produção de etanol lignocelulósico seja viável é a obtenção de um micro-organismo capaz de fermentar pentoses e hexoses de maneira eficiente. A levedura Saccharomyces cerevisiae é o principal micro-organismo utilizado nas fermentações industriais, devido à sua alta eficiência no consumo de glicose e tolerância às altas concentrações de etanol. Entretanto, linhagens selvagens dessa levedura não são capazes de consumir pentoses naturalmente. Desta maneira, a expressão heteróloga de genes que possibilitem o consumo de pentoses em S. cerevisiae é uma abordagem interessante que vem sendo desenvolvida por diversos grupos de pesquisa. A xilose é o açúcar de cinco carbonos presente em maior porcentagem nos materiais lignocelulósicos e é consumida pelos organismos através de duas vias principais, a via da xilose isomerase (XI) e a via oxi-redutiva. A bactéria Propionibacterium acidipropionici, industrialmente interessante por produzir ácido propiônico, foi estudada neste trabalho com relação à sua capacidade de consumir xilose. A partir dos ensaios de fermentação realizados, foi possível comprovar que ela é capaz de consumir este açúcar na msma proporção que a glicose. A análise de dados genômicos de P. acidipropionici indicou que a via da XI é a utilizada para o consumo de xilose. Assim, o gene xylA, que codifica a XI de P. acidipropionici, foi expresso em uma linhagem industrial de S. cerevisiae. Após a realização de testes fermentativos foi possível constatar que a linhagem construída não apresentou consumo de xilose. Apesar da expressão do gene xylA ser comprovada, não foi possível detectar atividade enzimática da XI, resultados que fornecem indícios de que a proteína pode não estar sendo sintetizada ou, caso esteja sendo sintetizada, não é funcional. Mais de 36 XIs provenientes de organismos diferentes já foram expressas em S. cerevisiae, dentre essas apenas 12 foram funcionalmente expressas. As causas da não funcionalidade na maioria das tentativas de expressão heteróloga das XIs são desconhecidas. Entretanto, alguns trabalhos afirmam que esse fenômeno viii pode estar relacionado ao enovelamento incorreto da xilose isomerase em S. cerevisiae. Desta forma, a expressão de genes que codificam chaperonas específicas é uma estratégia promissora para a obtenção de uma xilose isomerase funcional.
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