Tissue damage following injury leads to inflammation and fibrosis. To understand the molecular mechanisms and the proteins involved in the fibrotic process, we used the well-established unilateral ureteric obstruction rat model and we analyzed the alterations at early and late time intervals using a classical proteomic approach. Data analysis demonstrates a correlation between calreticulin up-regulation and progression of fibrosis. Calreticulin is involved in Ca++ homeostasis but has not been previously implicated in animal models of fibrosis. Proteomic analysis consistently revealed up-regulation of calreticulin in both early and late time intervals. These findings were further confirmed by biochemical and morphological approaches. Next, animal models of lung fibrosis (bleomycin-induced) and heart fibrosis (desmin-null) were examined. In the lung model, calreticulin expression was up-regulated from early time intervals, whereas in the heart model no change in the expression of calreticulin was observed. In addition, TGF-beta, a well known major contributing factor in several fibrotic processes, was found to up-regulate calreticulin in cultured human proximal tubule epithelial cells. The above observations suggest that calreticulin might be involved in fibrotic processes; however the mechanism(s) underlying its possible involvement are yet unresolved.
Our studies focus on ERp46, an endoplasmic reticulum (ER) component, and analyze its involvement in glucose toxicity and in insulin production. Differences in pancreatic beta-TC-6 cell proteome under conditions of low vs. high glucose were examined by proteomic approaches, including two-dimensional gel electrophoresis, image analysis, and mass spectrometry. Among differentially expressed proteins, ERp46, a novel endoplasmic reticulum component, was examined further. The expression of ERp46 in pancreatic sections was analyzed by immunocytochemistry, and high glucose-induced alterations of expression were evaluated in cultured beta-cells, in isolated pancreatic islets, and in the pancreas of db/db diabetic animals. Inhibition of ERp46 expression by siRNA was performed to study its role in insulin production, in secretion, and in ER stress. Proteomic analysis led to identification of 46 differentially expressed spots corresponding to 23 proteins. Since ERp46 is a novel protein with a possible crucial role in secretory cells, we further analyzed its role in beta-cell function. ERp46 expression is reduced in high glucose concentration in beta-TC-6 cells and in isolated murine islets. Further analysis revealed high expression of ERp46 in pancreatic islets compared with exocrine tissue. Interestingly, a marked decrease in ERp46 expression was found in the pancreatic islets of db/db mice. Most importantly, siRNA-mediated knockdown of ERp46 in cultured beta-cells led to a significant decrease in the insulin content; however, no alterations in insulin mRNA levels were observed under these conditions. In addition, reduced expression of ERp46 by siRNA increased the expression of CHOP and peIF2a, indicating development of ER stress. We conclude that ERp46 may be an important component in the phenomenon of "glucose toxicity" involved in insulin production at the posttranslational level.
ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2: ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ∆ΟΙ 2.1 Καλλιέργειες κυττάρων 2.1.1 Καλλιέργεια βTC-6 κυττάρων 2.1.2 Αποµόνωση νησιδίων και εξωκρινούς µοίρας παγκρέατος 2.1.3 Καλλιέργεια νησιδίων και εξωκρινούς µοίρας παγκρέατος 2.2 Αποµόνωση πρωτεϊνών 2.2.1 Προσδιορισµός της συγκέντρωσης πρωτεϊνών 2.3 Πρωτεοµική Ανάλυση 72 2.3.1. Ενυδάτωση των ταινιών ηλεκτροφόρησης πρώτης διάστασης 74 2.3.2. Προετοιµασία δειγµάτων 2.3.3. Ηλεκροφόρηση πρώτης διάστασης 2.3.4. Εξισορρόπηση των ταινιών ηλεκτροφόρησης πρώτης διάστασης 2.3.5 Ηλεκτροφόρηση δεύτερης διάστασης 2.3.6 Χρώση των πηκτωµάτων 2.3.7. Ανάλυση εικόνας 2.3.8. Ταυτοποίηση πρωτεϊνικών κηλίδων 2.4 Αποτύπωση Western (Western Blot) 2.4.1 Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών σε πήκτωµα πολυακρυλαµιδίου (PAGE) 2.4.2. Ανοσοαποτύπωση (immunoblotting) 2.4.3 Ανοσοαποτύπωµα σε πήκτωµα ηλεκτροφόρησης δύο διαστάσεων 2.5 Αποµόνωση ολικού κυτταρικού RNA από κύτταρα βTC-6 2.5.1 Προσδιορισµός της συγκέντρωσης και της καθαρότητας του RNA 2.5.2 Έλεγχος της ακεραιότητας του RNA 2.5.3 Επεξεργασία RNA µε DNAse 2.5.4 Αντίστροφη µεταγραφή 2.5.5 Αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης για τον έλεγχο της λειτουργίας εκκινητών 2.5.6 Πραγµατικού χρόνου αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης (Real-time polymerase chain reaction) 2.6 Ανοσοφθορισµός 2.6.1 Άµεσος και Έµµεσος Ανοσοφθοριµός 2.7 Ιστολογική επεξεργασία 2.7.1 Ανοσοιστοχηµεία iv 2.7.2 Ποσοτικοποίηση της ERp46 2.8 Ανοσοενζυµική µέθοδος ELISA 2.9 Επιµόλυνση κυττάρων 2.9.1 Επιµόλυνση µικρών παρεµβατικών 106 2.10 Στατιστική ανάλυση ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3: ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Πορεία Εργασίας 109 3.1 ∆ιαφορική έκφραση πρωτεϊνών υπό την επίδραση υψηλής γλυκόζη 110 3.2 Εστίαση της µελέτης στην πρωτεΐνη ERp46 115 3.3 Η έκφραση της ERp46 µειώνεται υπό την επίδραση υψηλής γλυκόζη σε βTC-6 κύτταρα 3.4 Ισοµορφές της πρωτεΐνης ERp46 σε χαµηλή και υψηλή γλυκόζη 119 3.5 Υψηλή έκφραση της ERp46 σε νησίδια παγκρέατος µυός 120 3.6 Μείωση της έκφρασης της ERp46 σε νησίδια παγκρέατος µυός υπό την επίδραση υψηλής γλυκόζης 3.7 Μείωση της έκφρασης της ERp46 σε τοµές παγκρέατος διαβητικών µυών 3.8 Καταστολή της έκφρασης της ERp46 µε µικρά παρεµβατικά µόρια RNA (siRNA) 3.9 Η καταστολή της έκφρασης της ERp46 µειώνει την ινσουλίνη 3.9.1 Εντοπισµός της ινσουλίνης και της ERp46 σε βTC-6 κύτταρα 3.9.2 Η µείωση της έκφρασης της ERp46 µειώνει την ινσουλίνη 3.9.3 Η µείωση της έκφρασης της ERp46 δεν επηρεάζει άλλες πρωτεΐνες 3.9.4 Η µείωση της έκφρασης της ERp46 µειώνει την ινσουλίνη χωρίς να επηρεάζει το GSIS 3.9.5 Η καταστολή της έκφρασης της ERp46 ελέγχει τη βιοσύνθεση της ινσουλίνης σε µετα-µεταφραστικό επίπεδο 3.9.5.1 Η καταστολή της έκφρασης της ERp46 µειώνει την έκφραση της προ-ινσουλίνης 3.9.5.2 Η καταστολή της έκφρασης της ERp46 δεν επηρεάζει τη µεταγραφή των γονιδίων της ινσουλίνης v 3.10 Η καταστολή της έκφρασης της ERp46 επάγει το stress του ενδοπλασµατικού δικτύου
scite is a Brooklyn-based organization that helps researchers better discover and understand research articles through Smart Citations–citations that display the context of the citation and describe whether the article provides supporting or contrasting evidence. scite is used by students and researchers from around the world and is funded in part by the National Science Foundation and the National Institute on Drug Abuse of the National Institutes of Health.
hi@scite.ai
10624 S. Eastern Ave., Ste. A-614
Henderson, NV 89052, USA
Copyright © 2024 scite LLC. All rights reserved.
Made with 💙 for researchers
Part of the Research Solutions Family.