The ThinPrep cervical smear is widely used in clinical practice for the cytological and molecular screening against abnormal cells and Human Papillomavirus (HPV) infection. Current advancements made to LC-MS proteomics include the use of stable isotope labeling for the in-depth analysis of proteins in complex clinical specimens. Such approaches have yet to be realized for ThinPrep clinical specimens. In this study, an LC-MS method based on isobaric (iTRAQ) labeling and high-resolution FT-Orbitrap mass spectrometry was used for the proteomic analysis of 23 human ThinPrep smear specimens. Tandem mass spectrometry analysis was performed with both nitrogen high collision dissociation (HCD MS/MS) and helium collision induced dissociation (CID MS/MS) peptide fragmentation modes. The analysis of three 8-plex sample sets yielded the identification of over 3200 unique proteins at FDR < 1%, of which over 2300 proteins were quantitatively profiled in at least one of the three experiments. The interindividual variability served to define the required sample size needed to identify significant protein expression differences. The degree of in-depth proteome coverage allowed the detection of 6 HPV-derived proteins including the high-risk HPV16 type in the specimens tested. The presence of the HPV strains of origin was also confirmed with PCR-hybridization molecular methods. This proof-of-principle study constitutes the first ever report on the nontargeted analysis of HPV proteins in human ThinPrep clinical specimens with high-resolution mass spectrometry. A further testament to the sensitivity and selectivity of the proposed study method was the confident detection of a significant number of phosphopeptides in these specimens.

Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής είναι η ανίχνευση και τυποποίηση των ιών των ανθρωπίνων θηλωμάτων (HPV) σε Ελληνίδες ασθενείς με ενδοεπιθηλιακά και διηθητικά τραχηλικά αδενοκαρκινώματα. Επιπρόσθετα, μελετήσαμε το υλικό μας ανοσοϊστοχημικά με την πρωτεϊνη p16 στην προσπάθειά μας να συνδέσουμε την έκφρασή της αφ’ενός με τις διάφορες ιστολογικές κατηγορίες της νόσου αφ’ετέρου και με τα διάφορα στελέχη HPV που ανιχνεύσαμε.Η μελέτη εκπονήθηκε στο Παθολογικό Ανατομείο της Ιατρικής Σχολής του Πανεπιστημίου Αθηνών ενώ το υλικό συλλέχθηκε από το αρχείο του Εργαστηρίου Παθολογικής Ανατομικής του Μαιευτηρίου «ΙΑΣΩ».Συγκεκριμένα, οι 148 περιπτώσεις που μελετήσαμε περιελάμβαναν δείγματα βιοψίας τραχήλου, υλικά κωνοειδών εκτομών καθώς και προϊόντα τραχηλεκτομών και υστερεκτομών, ενώ σε δύο περιπτώσεις το υλικό αφορούσε τραχηλικά επιχρίσματα. Τα αντίστοιχα πλακάκια δειγμάτων ελέγχθηκαν από δύο ειδικευμένους στην Γυναικολογική Παθολογία ιατρούς-παθολογοανατόμους. Τα περιστατικά στα οποία συνυπήρχε νεοπλασία του πλακώδους επιθήλιου ή νευροενδοκρινική νεοπλασία εξαιρέθηκαν από τη μελέτη.Τελικά, προχωρήσαμε στην ανάλυση και τυποποίηση συνολικά 78 περιπτώσεων τραχηλικών αδενοκαρκινωμάτων. Από αυτά, τα 20 αφορούσαν σε ενδοεπιθηλιακά (in situ) και τα 58 σε διηθητικά αδενοκαρκινώματα, συνήθους και ειδικού τύπου.Τα αποτελέσματά μας καταδεικνύουν τη μεγάλη συχνότητα ανεύρεσης HPV λοίμωξης σε Ελληνίδες ασθενείς με αδενοκαρκινώματα του τραχήλου της μήτρας, τόσο σε in situ (95%) όσο και σε διηθητικές νεοπλασίες (94,83%). Τα παραπάνω ποσοστά είναι υψηλότερα αυτών που παρουσιάζονται στη διεθνή βιβλιογραφία σε μελέτες πολυεθνικών ομάδων και τα οποία κυμαίνονται μεταξύ 65% και 85% αντίστοιχα.Όσον αφορά την ανεύρεση συγκεκριμένων HPV στελεχών, ο τύπος HPV16 εμφανίζεται πιο συχνά στα υπό εξέταση τραχηλικά δείγματα, ακολουθούμενος από τον HPV18, στις περισσότερες δε περιπτώσεις ως μεμονωμένη λοίμωξη, γεγονός που αναφέρεται και στις περισσότερες άλλες μελέτες. Το γεγονός αυτό θα μπορούσε να σηματοδοτεί μία πληθυσμιακή διαφοροποίηση του Ελληνικού πληθυσμού σε σχέση με τους υπόλοιπους υπό εξέταση. Ταυτόχρονα, η παρουσία του HPV52 , ως το τρίτο πιο συχνά ανευρισκόμενο HPV στέλεχος, σε συχνότητα 16,6%, πάντα όμως ως συλλοίμωξη είτε με τον HPV16 είτε με τον HPV18, αποτελεί ένα εύρημα που πιθανόν επίσης να αντιστοιχεί σε μία ιδιαιτερότητα του Ελληνικού πληθυσμού καθώς, αν και ο τύπος HPV52 αποτελεί ένα από τα περισσότερο υψηλής επικινδυνότητας HPV στελέχη, η κατανομή του παγκοσμίως, σε όλους τους ιστολογικούς τύπους των τραχηλικών καρκινωμάτων, τόσο εκ πλακωδών κυττάρων όσο και εκ του αδενικού επιθήλιου, είναι ιδιαίτερα χαμηλή, κυμαινόμενη από 2% στην Ευρώπη έως 4% στην Ασία. Αναφορικά με τα αποτελέσματα της ανοσοϊστοχημικής μας μελέτης, η ανεύρεση έντονης διάχυτης έκφρασης της πρωτείνης p16 στο μεγαλύτερο ποσοστό των περιπτώσεων συμβαδίζει με τα αποτελέσματα άλλων ερευνητών και επιβεβαιώνει τη χρησιμότητα της ανοσοϊστοχημείας με p16 στη διάγνωση μικροσκοπικών αλλοιώσεων κυρίως σε βιοπτικό υλικό. Αρνητική έκφραση παρατηρήσαμε σε σημαντικό ποσοστό των ειδικού τύπου καρκινωμάτων, γεγονός που επίσης αναφέρεται στη βιβλιογραφία. Σε κλινικό επίπεδο τα ευρήματα της μελέτης μας θα μπορούσαν να αποτελέσουν μία βάση, σε συνδυασμό και με το λοιπό ιατρικό ιστορικό της ασθενούς, στην εναρμόνιση της στρατηγικής των εμβολιασμών για HPV στον Ελληνικό πληθυσμό, καθώς σύντομα αναμένεται να κυκλοφορήσει στη χώρα μας ένα νέο 9-δύναμο εμβόλιο. Το εν λόγω σχήμα θα προσφέρει κάλυψη έναντι εννέα ΗPV στελεχών (6, 11, 16, 18, 31, 33, 45, 52 και 58) σε σύγκριση με το παλαιότερο 4-δύναμο (με προστασία στους τύπους HPV 6, 11, 16, 18).