Optimización del cultivo de queratinocitos humanos para el desarrollo de un modelo de piel artificial humana: alternativas celulares como capa alimentadora ResumenObjetivos: En el presente estudio se persigue optimizar el cultivo de queratinocitos para desarrollar un modelo de piel artificial humana. Para ello, se utilizan como capa alimentadora células de origen humano: fibroblastos dérmicos humanos y células mesenquimales troncales derivadas de tejido adiposo. Los resultados obtenidos se comparan con los fibroblastos 3T3, capa alimentadora de origen murino utilizada desde hace décadas. Metodología: Se llevó a cabo un estudio experimental, utilizando células de origen humano y células de origen murino subletalmente irradiadas, como capa alimentadora para el establecimiento del cultivo de queratinocitos. Se evaluó la tasa de expansión celular y la tasa de duplicación en el pase celular de queratinocitos y en la recuperación celular final que se llevó a cabo a las 3 semanas de cultivo; así como el rendimiento celular y la viabilidad celular, que también se evaluaron en el procesamiento inicial. Resultados: Los resultados determinan que los fibroblastos dérmicos humanos irradiados y las células mesenquimales troncales derivadas de tejido adiposo pueden actuar como capa alimentadora promoviendo la adhesión y la expansión celular de los queratinocitos. Los fibroblastos dérmicos humanos proporcionan resultados equiparables a los obtenidos con los fibroblastos 3T3 murinos. Conclusiones: Los fibroblastos dérmicos humanos irradiados proporcionan una capa alimentadora funcional que permite la expansión in vitro de manera eficaz de los queratinocitos que se van a utilizar con fines clínicos para el desarrollo de un modelo de piel artificial humana. AbstractPurpose: This study aims to optimize keratinocyte culture to develop an artificial human skin model. For this purpose, human cells are used as feeder layer: human dermal fibroblasts and adipose derived mesenchymal stem cells. The results obtained are compared with 3T3 fibroblasts, murine feeder layer used for decades. Methods: We conducted an experimental study using human and murine sub-lethally irradiated cells as feeder layer for the establishment of keratinocyte culture. Cell expansion rate and doubling rate were evaluated in the keratinocyte cell passage and in the final cell recovery (was carried out at 3 weeks). The yield and viability of keratinocytes were also evaluated in the initial processing. Results:The results determine that irradiated human dermal fibroblasts and irradiated adipose derived mesenchymal stem cells can act as feeder layer promoting adhesion and expansion of keratinocytes. Human dermal fibroblasts provide comparable results to those obtained with murine 3T3 fibroblasts. Conclusions: Irradiated human dermal fibroblasts provide a functional feeder layer which allows effectively in vitro expansion of keratinocytes to be used for clinical purposes for the development of an artificial human skin model.
Epithelial in vitro differentiation of human mesenchymal stem cells (hMSCs) from adipose tissue (AT) and bone marrow (BM): cellular characterization and study of HLA I and II expression
Estudio piloto de tolerabilidad cutánea de láminas de fibrina-agarosa en voluntarios sanos ResumenObjetivos: En el presente estudio se persigue comprobar posibles reacciones adversas, derivadas del uso tópico de láminas de fibrina-agarosa en el antebrazo de voluntarios sanos. Metodología: Se llevó a cabo un estudio experimental en siete voluntarios sanos, cinco varones y dos mujeres, que no presentaban ningún tipo de lesión cutánea visible. En el antebrazo de cada voluntario se colocaron dos láminas de fibrina-agarosa de 4 cm 2 . Cada lámina se cubrió con un apósito impregnado y sobre una de las láminas se aplicó pomada antibiótica con mupirocina. Ambas láminas se cubrieron finalmente con un apósito protector y se mantuvieron en contacto directo sobre la piel durante 48 horas. Resultados: Los resultados determinaron que no se detectaron reacciones adversas después de 48 horas de evolución ni en los siguientes 7 días en ningún voluntario. Se observaron diferencias entre las dos láminas implantadas en cada voluntario, ya que al retirar el apósito cubierto con pomada antibiótica, la lámina presentaba un aspecto más hidratado que la que no llevaba pomada antibiótica. Conclusiones: El uso tópico de las láminas de fibrina-agarosa en voluntarios sanos no presenta reacciones adversas del tipo irritación o alergia al aplicarse directamente por vía tópica. Aunque el tamaño muestral del estudio es limitado, sugiere que la combinación de fibrina-agarosa se presenta como el biomaterial idóneo para el desarrollo de un modelo de piel artificial humana. AbstrasctPurpose: This study aims to analyse possible adverse reactions resulting from the topical use of fibrin-agarose substitutes in the forearm of healthy volunteers. Methods: An experimental study was carried out in seven healthy volunteers, five males and two females, who did not have any cutaneous lesion. Two fibrin-agarose substitutes of 4 cm2 were placed in the forearm of each volunteer. Each substitute was covered with an impregnated dressing and one of the substitutes was covered with antibiotic ointment (mupirocin). Both substitutes were finally covered with a protective dressing. The substitutes were maintained for 48 hours. Results:The results determined that no adverse reactions were detected in any volunteer after 48 hours and a week of evolution. Differences were observed between the two substitutes implanted in each volunteer, since when removing the covered dressing with antibiotic ointment, the substitute presented a more hydrated appearance than the one without antibiotic cream. Conclusions: The implant of fibrin-agarose substitutes in healthy volunteers does not present irritation or allergic type adverse reactions when they applied directly topically on the skin. Although the sample size is low, the fibrin-agarose combination is presented as the biomaterial suitable for the development of an artificial human skin model. Enviado: 01-12-2016 Revisado:14-12-2016 Aceptado: 23-12-2016 Palabras clave: Láminas de fibrina-agarosa, Piel artificial, Tolerabilidad...
Validación del sistema automatizado Bact/Alert en el control microbiológico de productos celulares de Terapias Avanzadas Resumen Objetivo. El Control de calidad para demostrar que un producto está libre de agentes microbianos adventicios es un aspecto clave de control de procesos y evaluación de la calidad de todas las preparaciones medicinales celulares y en la ingeniería tisular. El objetivo de este estudio es validar el sistema de detección por hemocultivo BacT / ALERT para el control microbiológico de las células mesenquimales para terapia celular, según la Farmacopea Europea (EU.PH), 2.6.27. "Control microbiológico de productos celulares" (1). Método. Para el cálculo del límite de detección las botellas de hemocultivo fueron inoculadas e incubadas con 4 réplicas de 30 UFC, 5 réplicas de 15 UFC y 5 réplicas de 6 UFC de los microorganismos en ausencia de producto celular. Se llevaron a cabo también experimentos en presencia de producto con 400.000 células mesenquimales. Este método se ha comparado con el método de referencia de Esterilidad de la EU.PH (2). La especificidad se ensayó inoculando 5 réplicas con 400.000 células mesenquimales sin microorganismos. Resultados. Todas las botellas inoculadas con células mesenquimales sin microorganismos permanecieron negativas después de 7 días de incubación. Todas las botellas inoculadas con cepas bacterianas aerobias y anaerobias fueron detectadas como positivas por el sistema, en el caso del límite inferior (6 UFC) en menos de 36 horas. Se detectaron como positivas las botellas inoculadas con Candida albicans (6 UFC) en menos de 48 horas y con Aspergillus niger (6 UFC) en menos de 72 horas. No hubo diferencias notables en el tiempo de detección entre botellas inoculadas con y sin la presencia de células mesenquimales. Conclusión: El sistema de detección de hemocultivos Bact/Alert es un método fiable para la detección de la contaminación microbiana de medicamentos a base de células mesenquimales y cumple los requisitos de la UE PH, 2.6.27, para el control microbiológico de productos celulares.
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