Seronegative myasthenia gravis (MG) presents a serious gap in MG diagnosis and understanding. We applied a cell based assay (CBA) for the detection of muscle specific kinase (MuSK) antibodies undetectable by radioimmunoassay. We tested 633 triple-seronegative MG patients' sera from 13 countries, detecting 13% as positive. MuSK antibodies were found, at significantly lower frequencies, in 1.9% of healthy controls and 5.1% of other neuroimmune disease patients, including multiple sclerosis and neuromyelitis optica. The clinical data of the newly diagnosed MuSK-MG patients are presented. 27% of ocular seronegative patients were MuSK antibody positive. Moreover, 23% had thymic hyperplasia suggesting that thymic abnormalities are more common than believed.

Estradiol (E2)-estrogen receptor (ER) actions are implicated in initiation, growth and progression of hormone-dependent breast cancer. Crosstalk between ERs, epidermal growth factor receptor (EGFR) and/or insulin-like growth factor receptor (IGFR) is critical for the observed resistance to endocrine therapies. Cell surface heparan sulfate proteoglycans (HSPGs) are principal mediators of cancer cell properties and the E2-ER pathway as well as those activated by EGFR and IGFR have significant roles in regulating the expression of certain cell surface HSPGs, such as syndecan-2 (SDC-2), syndecan-4 (SDC-4) and glypican-1. In this study, we therefore evaluated the role of EGFR-IGFR signaling on the constitutive expression and E2-mediated expression of ERs and HSPGs as well as the effect of E2-ERs and IGFR/EGFR-mediated cell migration in ERa+ (MCF-7) and ERb+ (MDA-MB-231) breast cancer cells using specific intracellular inhibitors of EGFR and IGFR. We report that the expression of ERa is mainly enhanced by IGFR, whereas ERb expression is mainly coordinated by EGFR. Moreover, constitutive SDC-2 expression in ERa+ and ERb+ cells is mainly mediated through the IGFR, whereas in ERa+ E2-treated cells EGFR is the active one. In contrast, SDC-4 expression is regulated by IGFR in the presence and absence of E2. E2 also seems to diminish the inhibitory effect of EGFR and IGFR inhibitors in breast cancer cell migration. These data suggest that the coordinated action of ERs with EGFR and/or IGFR is of crucial importance, providing potential targets for designing and developing novel multi-potent agents for endocrine therapies.

No abstract

ObjectiveAmyotrophic lateral sclerosis (ALS) and myasthenia gravis (MG) are caused, respectively, by motor neuron degeneration and neuromuscular junction (NMJ) dysfunction. The membrane protein LRP4 is crucial in the development and function of motor neurons and NMJs and LRP4 autoantibodies have been recently detected in some MG patients. Because of the critical role in motor neuron function we searched for LRP4 antibodies in ALS patients.MethodsWe developed a cell-based assay and a radioimmunoassay and with these we studied the sera from 104 ALS patients.ResultsLRP4 autoantibodies were detected in sera from 24/104 (23.4%) ALS patients from Greece (12/51) and Italy (12/53), but only in 5/138 (3.6%) sera from patients with other neurological diseases and 0/40 sera from healthy controls. The presence of LRP4 autoantibodies in five of six tested patients was persistent for at least 10 months. Cerebrospinal fluid samples from six of seven tested LRP4 antibody-seropositive ALS patients were also positive. No autoantibodies to other MG autoantigens (AChR and MuSK) were detected in ALS patients. No differences in clinical pattern were seen between ALS patients with or without LRP4 antibodies.ConclusionsWe infer that LRP4 autoantibodies are involved in patients with neurological manifestations affecting LRP4-containing tissues and are found more frequently in ALS patients than MG patients. LRP4 antibodies may have a direct pathogenic activity in ALS by participating in the denervation process.

No abstract

Ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες της νευρομυϊκής σύναψης και χρήση τους στην ανάπτυξη διαγνωστικών μεθόδων για τη μυασθένειαΗ βαριά μυασθένεια (MG) αποτελεί μια αυτοάνοση νόσο η οποία χαρακτηρίζεται από μυϊκή αδυναμία. Η παθολογία της νόσου προκαλείται από την παρουσία αυτοαντισωμάτων που στοχεύουν πρωτεΐνες της νευρομυϊκής σύναψης (NMJ). Πιο συγκεκριμένα, αντιγονικούς στόχους αποτελούν ο AChR, σε ποσοστό 80-85% των ασθενών, η MuSK σε ποσοστό 5-7% και η LRP4 σε ποσοστό 2-3%. Παρά την εκτεταμένη έρευνα, το ποσοστό των οροαρνητικών μυασθενών (SN-MG), δηλαδή ασθενών που δεν φέρουν αντισώματα για κανένα από τα ήδη γνωστά αντιγόνα, αποτελεί ένα σοβαρό κενό για την πλήρη κατανόηση της νόσου. Το γεγονός αυτό πιθανώς οφείλεται στην ύπαρξη άγνωστων μέχρι σήμερα αντιγόνων ή/και στη χαμηλή ευαισθησία των τεχνικών ανίχνευσης που είναι διαθέσιμες.Η παρούσα διδακτορική διατριβή έχει ως στόχο την ανάπτυξη ευαίσθητων διαγνωστικών τεχνικών για την ανίχνευση αυτοαντισωμάτων έναντι των αντιγόνων LRP4 και MuSK συνεισφέροντας στη μείωση των SN-MG. Η ανίχνευση των αντι-LRP4 αντισωμάτων πραγματοποιείται από την ευαίσθητη αλλά μόνο ποιοτική CBA τεχνική. Η ανάπτυξη μιας τεχνικής (RIPA, ELISA) για την ποσοτικοποίηση αυτών των αντισωμάτων είναι απαραίτητη για την παρακολούθηση της νόσου. Αντιθέτως, σε ότι αφορά στην MuSK-MG, πολύτιμη είναι η ανάπτυξη μιας ευαίσθητης τεχνικής όπου η MuSK θα βρίσκεται στην φυσική της διαμόρφωση (όπως στο CBA), σε αντίθεση με τις μέχρι σήμερα χρησιμοποιούμενες τεχνικές (RIPA). Με αυτό τον τρόπο θα είναι δυνατός ο εντοπισμός χαμηλής συγκέντρωσης αντι-MuSK αντισωμάτων ή αντισωμάτων που απαιτούν τη σωστά δομημένη πρωτεΐνη για να ανιχνευθούν. Η ανάπτυξη μιας ποσοτικής και ευαίσθητης διαγνωστικής μεθόδου ανίχνευσης αντισωμάτων προϋποθέτει την παραγωγή, απομόνωση και καθαρισμό ενός πολύ καλά δομημένου και ακέραιου αντιγόνου. Η ανθρώπινη LRP4 είναι μια μεγάλη διαμεμβρανική πρωτεΐνη (212 kDa) με πολύπλοκες μεταμεταφραστικές τροποποιήσεις. Η πολυπλοκότητα της συγκεκριμένη πρωτεΐνης καθιστά ιδιαίτερα δύσκολη την παραγωγή της σε ετερόλογα συστήματα έκφρασης. Συνεπώς, επιπλέον από την μοριακή κατασκευή για την έκφραση της διαμεμβρανικής LRP4, πραγματοποιήθηκαν προσπάθειες έκφρασης της εξωκυττάριας περιοχής (ΕΚΠ) της, καθώς και λειτουργικών τμημάτων αυτής. Τα συστήματα έκφρασης που χρησιμοποιήθηκαν επιλέχθηκαν με γνώμονα τους μεταμεταφραστικούς μηχανισμούς που διαθέτουν, καθώς και με την ικανότητα τους να εκφράσουν μεγάλες ποσότητες των επιθυμητών πρωτεϊνών. Πιο συγκεκριμένα, για την έκφραση ολόκληρης της LRP4 (1905aa) καθώς και της LRP4-ΕΚΠ (21-1725aa) πρωτεΐνης, χρησιμοποιήθηκαν τα ευκαρυωτικά συστήματα έκφρασης των κυττάρων εντόμων (Sf9) επιμολυσμένα με βακιλοϊό και των θηλαστικών κυττάρων (HEK293), αντίστοιχα. Τα παραπάνω συστήματα έκφρασης είναι ικανά να εκφράσουν σωστά δομημένες πρωτεΐνες, με πλήρως λειτουργική δομή, αλλά συνήθως σε μικρές ποσότητες. Για την έκφραση των μικρότερων αλλά λειτουργικών τμημάτων της LRP4 χρησιμοποιήθηκαν τα συστήματα έκφρασης του ζυμομύκητα P. pastoris και των βακτηρίων E.Coli (BL21). Χαρακτηριστικό των συγκεκριμένων συστημάτων έκφρασης είναι οι μεγάλες ποσότητες πρωτεΐνης που μπορούν να παράξουν. Υπολείπονται όμως στο επίπεδο μεταμεταφραστικών μηχανισμών καθιστώντας δυσκολότερη την έκφραση πολύπλοκων πρωτεϊνικών μορίων. Τα τμήματα της LRP4 όπου τα επίπεδα έκφρασης και καθαρότητας επέτρεπαν την ανάπτυξη διαγνωστικών εργαλείων, χρησιμοποιήθηκαν με στόχο την ανίχνευση αντι-LRP4 αντισωμάτων. Πιο συγκεκριμένα, το LRP4-ΕΚΠ χρησιμοποιήθηκε ως καθηλωμένο αντιγόνο για την ανάπτυξη έμμεσης ELISA, εφαρμογή της οποίας επιβεβαίωσε μόνο το 14% των θετικών για LRP4 αντισώματα MG ασθενών (προηγουμένως ελεγμένοι με CBA). Επιπρόσθετα, πραγματοποιήθηκε ανάπτυξη μιας ακόμα έμμεσης ELISA με τα τμήματα της LRP4 (785-1093aa, 1093-1439aa και 1004-1306aa) που εκφράστηκαν στο σύστημα έκφρασης των βακτηρίων ως καθηλωμένα αντιγόνα. Με την τεχνική αυτή επιβεβαιώθηκε πάλι περίπου το 10% των LRP4-MG. Ωστόσο, έπειτα από ιωδίωση του τμήματος 21-737aa της LRP4 που εκφράστηκε στον ζυμομύκητα P. pastoris αναπτύχθηκε μια τεχνική RIPA, η εφαρμογή της οποίας ανίχνευσε το 41,2% των θετικών MG για LRP4 αντισώματα. Συνεπώς η RIPA είναι η περισσότερο ευαίσθητη από τις διαγνωστικές τεχνικές που αναπτύχθηκαν. Οι προσπάθειες για την αύξηση της ευαισθησίας των διαγνωστικών εργαλείων που έχουν κατασκευασθεί συνεχίζονται, με στόχο τον ποσοτικό προσδιορισμό των LRP4 αντισωμάτων σε όλους τους LRP4-MG ασθενείς.Στο δεύτερο μέρος της διδακτορικής διατριβής πραγματοποιήθηκε έλεγχος τριπλά αρνητικών ορών μυασθενών με την MuSK-CBA τεχνική που αναπτύχθηκε. Πιο συγκεκριμένα, ελέγχθηκαν 633 SN-MG από 13 χώρες. Από τα αποτελέσματα βρέθηκε πως το 13% των SN-MG φέρει αντισώματα έναντι της πρωτεΐνης MuSK. Η ειδικότητα της μεθόδου επιβεβαιώθηκε έπειτα από έλεγχο ορών υγιών δοτών και ασθενών με άλλες νευρολογικές νόσους εκ των οποίων βρέθηκαν θετικοί σε ποσοστό 1,9% και 5,1% αντίστοιχα. Επιπρόσθετα, ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι με τη συγκεκριμένη τεχνική ανιχνεύθηκε σημαντικός αριθμός διπλά θετικών ορών (AChR/MuSK και LRP4/MuSK) υποδηλώνοντας πως το συνολικό ποσοστό των πααραπάνω είναι τελικά μεγαλύτερο από αυτό που θεωρείται μέχρι σήμερα. Επιπλέον, πραγματοποιήθηκε συλλογή και εκτίμηση των κλινικών χαρακτηριστικών των MuSK-CBA θετικών ασθενών. Συνοπτικά, το 27% των SN-MG με οφθαλμική MG (i.e. αποκλειστική εμφάνιση οφθαλμικών συμπτωμάτων) φέρουν αντισώματα έναντι της MuSK. Επιπρόσθετα, το 23% των προσφάτως ανιχνευμένων MuSK-MG εμφανίζει υπερπλασία του θύμου. Τα ποσοστά αυτά είναι πολύ υψηλότερα από εκείνα που έχουν περιγραφεί για τους RIPA θετικούς MuSK-MG ασθενείς.Η φαρμακευτική αγωγή που λαμβάνουν οι μυασθενείς εξαρτάται από το είδος των αντισωμάτων που φέρουν. Επιπρόσθετα, η πορεία της MG φαίνεται να σχετίζεται σε πολλές περιπτώσεις με την συγκέντρωση των αντισωμάτων αυτών. Συνεπώς η ανάπτυξη διαγνωστικών εργαλείων όπως αυτών που παρουσιάζονται στην παρούσα διατριβή μπορεί να οδηγήσουν σε καλύτερη και γρηγορότερη αντιμετώπιση της νόσου, βελτιώνοντας την ποιότητα ζωής των MG ασθενών.

Estrogens regulate several physiological processes and are implicated in the growth of solid tumors, such as breast and colon. 17â‐estradiol (E2), particularly influences estrogen receptor (ER) expression. ER is synthesized in many cell types as two protein forms, ERá and ERâ, which are products of separate genes. E2 signaling is supposed to be mediated via linear pathway involving insulin‐like growth factor receptor (IGF‐R) and epidermal growth factor receptor (EGFR). The aim of this study was therefore to examine whether estradiol affects the expression of ERs and proteoglycans (PGs) implicated in breast and colon cancers as well as whether this effect is associated with ER/IGF‐R/EGFR system. In vitro studies were performed on a panel of breast and colon cell lines in the presence or absence of E2 and specific IGF‐R, EGFR tyrosine kinase inhibitors. The results showed that E2 affected on the gene expression of syndecan‐4 and is closely related with the expression balance between ERá/ERâ and the crosstalk between crucial ER/IGF‐R/EGFR pathways.