To mimic more realistic lung tissue conditions, co-cultures of epithelial and immune cells are one comparatively easy-to-use option. To reveal the impact of immune cells on the mode of action (MoA) of CuO nanoparticles (NP) on epithelial cells, A549 cells as a model for epithelial cells have been cultured with or without differentiated THP-1 cells, as a model for macrophages. After 24 h of submerged incubation, cytotoxicity and transcriptional toxicity profiles were obtained and compared between the cell culture systems. Dose-dependent cytotoxicity was apparent starting from 8.0 µg/cm2 CuO NP. With regard to gene expression profiles, no differences between the cell models were observed concerning metal homeostasis, oxidative stress, and DNA damage, confirming the known MoA of CuO NP, i.e., endocytotic particle uptake, intracellular particle dissolution within lysosomes with subsequent metal ion deliberation, increased oxidative stress, and genotoxicity. However, applying a co-culture of epithelial and macrophage-like cells, CuO NP additionally provoked a pro-inflammatory response involving NLRP3 inflammasome and pro-inflammatory transcription factor activation. This study demonstrates that the application of this easy-to-use advanced in vitro model is able to extend the detection of cellular effects provoked by nanomaterials by an immunological response and emphasizes the use of such models to address a more comprehensive MoA.
The occupational exposure to particles such as crystalline quartz and its impact on the respiratory tract have been studied extensively in recent years. For hazard assessment, the development of physiologically more relevant in-vitro models, i.e., air-liquid interface (ALI) cell cultures, has greatly progressed. Within this study, pulmonary culture models employing A549 and differentiated THP-1 cells as mono-and co-cultures were investigated. The different cultures were exposed to α-quartz particles (Min-U-Sil5) with doses ranging from 15 to 66 µg/cm2 under submerged and ALI conditions and cytotoxicity as well as cytokine release were analyzed. No cytotoxicity was observed after ALI exposure. Contrarily, Min-U-Sil5 was cytotoxic at the highest dose in both submerged mono- and co-cultures. A concentration-dependent release of interleukin-8 was shown for both exposure types, which was overall stronger in co-cultures. Our findings showed considerable differences in the toxicological responses between ALI and submerged exposure and between mono- and co-cultures. A substantial influence of the presence or absence of serum in cell culture media was noted as well. Within this study, the submerged culture was revealed to be more sensitive. This shows the importance of considering different culture and exposure models and highlights the relevance of communication between different cell types for toxicological investigations.
In vitro lung cell models like air-liquid interface (ALI) and 3D cell cultures have advanced greatly in recent years, being especially valuable for testing advanced materials (e.g., nanomaterials, fibrous substances) when considering inhalative exposure. Within this study, we established submerged and ALI cell culture models utilizing A549 cells as mono-cultures and co-cultures with differentiated THP-1 (dTHP-1), as well as mono-cultures of dTHP-1. After ALI and submerged exposures towards α-quartz particles (Min-U-Sil5), with depositions ranging from 15 to 60 µg/cm2, comparison was made with respect to their transcriptional cellular responses employing high-throughput RT-qPCR. A significant dose- and time-dependent induction of genes coding for inflammatory proteins, e.g., IL-1A, IL-1B, IL-6, IL-8, and CCL22, as well as genes associated with oxidative stress response such as SOD2, was observed, even more pronounced in co-cultures. Changes in the expression of similar genes were more pronounced under submerged conditions when compared to ALI exposure in the case of A549 mono-cultures. Hereby, the activation of the NF-κB signaling pathway and the NLRP3 inflammasome seem to play an important role. Regarding genotoxicity, neither DNA strand breaks in ALI cultivated cells nor a transcriptional response to DNA damage were observed. Altogether, the toxicological responses depended considerably on the cell culture model and exposure scenario, relevant to be considered to improve toxicological risk assessment.
In den letzten Jahrzehnten kam es zu einer zunehmenden industriellen Entwicklung und Verwendung von Nano‐ und Mikropartikeln sowie faserförmigen Materialien, die insbesondere bei Inhalation zur Ausbildung besorgniserregender Lungenpathologien wie Inflammationen, Fibrosen und Lungenkrebs führen können. Dieses Risiko in Hinblick auf die Exposition von Arbeitskräften und Konsumenten erfordert eine umfassende Charakterisierung der Materialien in Hinblick auf deren Materialeigenschaften und Toxikologie. Im Rahmen der toxikologischen Untersuchungen wird angestrebt, die Verwendung von /n‐v/Vo‐Experimenten möglichst zu reduzieren und alternative Methoden im in‐vitro‐Bereich zu entwickeln, die eine möglichst realistische Nachstellung der physiologischen Antwort liefern. Aus diesem Grund kommen vermehrt Zellkulturmodelle an der Luft‐Flüssigkeitsgrenzschicht (engl. a/r‐l/qu/d interface: ALI) zum Einsatz, bei denen Lungenepithelzellen auf einer porösen Membran kultiviert werden, sodass sie apikal gegenüber der Umgebungsluft und Aerosolen ausgesetzt werden können. In einer Weiterentwicklung der ALI‐Modelle können unterschiedliche Zellarten der Lunge zur Nachstellung der Kommunikation zwischen Lungenzellen integriert werden.Im ersten Teil dieser Arbeit wurde ein Vergleich unterschiedlicher Zellkulturmodelle mithilfe des bereits detailliert erforschten Quarzes Min‐U‐Sil5 durchgeführt. Hierzu wurde die Alveolarepithelzelllinie A549 im Rahmen einer klassischen Kultivierung submers sowie an einem ALI in der Vitrocell® Cloud gegen über Quarzpartikeln exponiert. Zusätzlich wurden Cokulturen aus A549‐Zellen und Makrophagen‐ähnlichen dTHP‐1‐Zellen etabliert, die ebenfalls submers und am ALI mit Quarzpartikeln behandelt wurden. Für ein vertieftes Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismen wurde zusätzlich eine submerse dTHP‐1‐ Monokultur mitgeführt. Die fünf Modelle wurden hinsichtlich einer Zytotoxizität, Änderungen der Genexpression, Inflammation und Genotoxizität nach Quarzexposition untersucht. Es wurde festgestellt, dass die submersen Modelle empfindlicher gegenüber Quarzpartikeln reagierten als die ALI‐Modelle, sowohl im Falle der A549‐Mono‐ als auch im Falle der A549/dTHP‐1‐Cokultur. Dies wurde durch eine verstärkte Zytotoxizität und eine höhere Inflammationsantwort auf Ebene der Genexpression und Zytokinfreisetzung ersichtlich. Dieser Effekt konnte mutmaßlich auf Unterschiede in der Partikelvorbereitung sowie die Ausbildung von protektivem Surfactant durch A549‐Zellen zurückgeführt werden. Die Integration von dTHP‐1‐Zellen als Teil der Cokultur führte zu einer Verstärkung der inflammatorischen Antwort und zu einer Zytokinfreisetzung, die höher als die kombinierten Effekte der jeweiligen Monokulturen war. Dies spricht für eine erfolgreiche Kommunikation zwischen Epithelzellen und Makrophagen. Als zugrunde liegende toxikologische Mechanismen wurden die Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF‐kB und des NLRP3‐ Inflammasoms postuliert, welche für die umfassende inflammatorische Antwort zuständig sind und mutmaßlich durch Endozytose der Partikel und nachfolgende Bildung von ROS an der Partikeloberfläche induziert wurden. Eine zeitaufgelöste Betrachtung hob die Bedeutung hervor, eine Zeitabhängigkeit zellulärer Antworten zu berücksichtigen.Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden Carbonfasern (CF) als innovatives und in der Industrie relevantes Material mithilfe von ALI‐Modellen unter Verwendung der gleichen toxikologischen Endpunkte untersucht. Hierbei wurden die CF nicht in ihrer nativen Form untersucht, sondern zuvor einer mechanischen Behandlung bzw. einer thermischmechanischen Behandlung unterzogen. Dies sollte mechanischen und thermischen Stress simulieren, dem CF im Laufe ihres Lebenszyklus ausgesetzt sind. Für die Experimente mit CF kamen Zellkulturmodelle auf Basis der Bronchialepithelzelllinie BEAS‐2B zum Einsatz: es wurden BEAS‐2B‐Monokulturen, BEAS‐2B/dTHP‐1‐Cokulturen und Triplekulturen durch Zusatz der Fibroblastenzelllinie CCD‐33Lu verwendet. Die Exposition fand in der Vitrocell® Automated Exposure Station statt. Der Fokus lag auf der zeitabhängigen Betrachtung der CF‐ Toxizität, sodass Expositionen lediglich mit einer Dosis durchgeführt, jedoch variierende Nachinkubationszeiträume von 0, 3 oder 23 h angeschlossen wurden. Während mechanisch behandelte CF keine Zytotoxizität auslösten, kam es bei Exposition gegenüber thermischmechanisch behandelten CF zu einer signifikanten Reduktion der Zellzahl bei gleich bleibender LDH‐Freisetzung. Da im Verlauf der Experimente eine starke Agglomeration der thermischmechanisch behandelten CF beobachtet worden war, wurde vermutet, dass ein Teil der Zellen durch Adhärenz an die CF‐Agglomerate verloren ging, ohne dass Membranschäden entstanden und eine LDH‐Freisetzung erfolge. Dieser Effekt hatte zusätzliche Auswirkungen auf andere Endpunkte. Beispielsweise kam es in der Cokultur zu einer Repression der für Makrophagen spezifischen Gene TNF‐A und CCL22, was für einen primären Verlust der dTHP‐ 1‐Zellen durch eine potenzielle Bindung dieser Zellen an Faseragglomerate spricht. Daneben wurden sowohl in der Mono‐ als auch in der Cokultur diverse Gene der Inflammation und Apoptose verstärkt exprimiert, während die Exposition gegenüber mechanisch behandelten CF nur zu Änderungen in einzelnen Genen dieser Cluster führte. In vergleichbarer Weise wurde für die thermisch‐mechanisch behandelten CF eine höhere Zytokinfreisetzung detektiert. Die beobachteten Effekte wiesen erneut auf die Bedeutung von NF‐kB und des Inflammasoms hin, sowie auf eine Beteiligung diverser Bestandteile der MAPK‐Signalkaskade, die für eine Regulation des Zellzyklus, der Apoptose und Proliferation der Zellen zuständig ist. Eine Genotoxizität konnte nicht eindeutig bestätigt werden, da nur eine schwache Induktion von DNA‐Strangbrüchen durch mechanisch behandelte CF ermittelt werden konnte und lediglich einzelne Gene des Clusters “DNA‐Schadensantwort” induziert wurden. Die Triplekultur erwies sich durch widersprüchliche Ergebnisse in den Genexpressionsanalysen und Schwierigkeiten bei der Anwendung als instabil, zeigte jedoch durch eine außergewöhnlich hohe Zytokinfreisetzung und die Induktion einer sekundären Genotoxizität Potential für eine zukünftige Anwendung.Es kann zusammengefasst werden, dass es sich bei ALI‐Zellkulturmodellen um ein nützliches Werkzeug für die Weiterentwicklung der Partikel‐ und Fasertoxikologie handelt. Es handelt sich bei dem ersten Teil der Arbeit um einen systematischen Vergleich verschiedener in‐vitro‐ Modelle in Hinblick auf Mechanismen der Quarztoxizität. Die Expositionen zeigten, dass toxikologische Effekte durch Verwendung submerser Kulturen potenziell überschätzt und durch die alleinige Verwendung von Monokulturen unterschätzt werden können. Die Verwendung von Cokulturen mit Makrophagen‐ ähnlichen Zellen erwies sich als besonders gut geeignet für eine Betrachtung inflammatorischer Prozesse. Der zweite Teil dieser Arbeit stellt die erste umfassende toxikologische Charakterisierung von CF in komplexeren in‐vitro‐ Systemen dar. Aus den Ergebnissen wird die toxikologische Relevanz von CF sowie die Abhängigkeit toxikologischer Antworten von der Behandlungsart und Beschaffenheit der resultierenden Strukturen deutlich.
In recent years, the use of carbon fibers (CFs) in various sectors of industry has been increasing. Despite the similarity of CF degradation products to other toxicologically relevant materials such as asbestos fibers and carbon nanotubes, a detailed toxicological evaluation of this class of material has yet to be performed. In this work, we exposed advanced air–liquid interface cell culture models of the human lung to CF. To simulate different stresses applied to CF throughout their life cycle, they were either mechanically (mCF) or thermo-mechanically pre-treated (tmCF). Different aspects of inhalation toxicity as well as their possible time-dependency were monitored. mCFs were found to induce a moderate inflammatory response, whereas tmCF elicited stronger inflammatory as well as apoptotic effects. Furthermore, thermal treatment changed the surface properties of the CF resulting in a presumed adhesion of the cells to the fiber fragments and subsequent cell loss. Triple-cultures encompassing epithelial, macrophage, and fibroblast cells stood out with an exceptionally high inflammatory response. Only a weak genotoxic effect was detected in the form of DNA strand breaks in mono- and co-cultures, with triple-cultures presenting a possible secondary genotoxicity. This work establishes CF fragments as a potentially harmful material and emphasizes the necessity of further toxicological assessment of existing and upcoming advanced CF-containing materials.
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