Modifying cyclic cell‐penetrating deca‐arginine (cR10) peptides with 4‐(4‐dimethylaminophenylazo)benzoic acid (DABCYL) improves the uptake efficiency of synthetic ubiquitin (Ub) cargoes into living cells. To probe the role of the DABCYL moiety, we performed time‐lapse microscopy and fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) of fluorescent DABCYL‐R10 to evaluate the impact on cell entry by the formation of nucleation zones. Furthermore, we performed a structure–uptake relationship study with 13 DABCYL derivatives coupled to CPP to examine their effect on the cell‐uptake efficiency when conjugated to mono‐Ub through disulfide linkages. Our results show that through structure variations of the DABCYL moiety alone we could reach, at nanomolar concentration, an additional threefold increase in the cytosolic delivery of Ub, which will enable studies on various intracellular processes related to Ub signaling.
Developing an effective binder for a specific ubiquitin (Ub) chain is a promising approach for modulating various biological processes with potential applications in drug discovery. Here, we combine the Random Non-standard Peptides Integrated Discovery (RaPID) method and chemical protein synthesis to screen an extended library of macrocyclic peptides against synthetic Lys63-linked Di-Ub to discover a specific binder for this Ub chain. Furthermore, next-generation binders are generated by chemical modifications. We show that our potent cyclic peptide is cell-permeable, and inhibits DNA damage repair, leading to apoptotic cell death. Concordantly, a pulldown experiment with the biotinylated analog of our lead cyclic peptide supports our findings. Collectively, we establish a powerful strategy for selective inhibition of protein-protein interactions associated with Lys63-linked Di-Ub using cyclic peptides. This study offers an advancement in modulating central Ub pathways and provides opportunities in drug discovery areas associated with Ub signaling.
This work describes ab initio RaPID selection and consequent rational mutagenesis for the selection process to improve the binding affinity of macrocyclic peptide toward Lys48-linked di-Ub.
Den Autoren ist aufgefallen, dass aufgrund eines Bearbeitungsfehlers ein falscher Massenbereich in der Grundlinie der Spektren in drei Abbildungen in den Hintergrundinformationen (Abbildungen S14-S16) angezeigt wurde. Außerdem wurde ein Fehler in den HRMS-Daten von Verbindung D11 gefunden. Eine aktualisierte Version der Hintergrundinformationen, in der diese Fehler korrigiert wurden, wird mit dieser Berichtigung bereitgestellt. Diese Korrekturen ändern nichts an den Schlussfolgerungen dieser Arbeit.
Die Modifizierung zyklischer zelldurchdringender Deca-Arginin (cR10)-Peptide mit 4-(4-Dimethylaminophenylazo)-benzoesäure (DABCYL) verbessert die Aufnahmeeffizienz synthetischer Ubiquitine (Ub) in lebende Zellen. Um die Rolle der DABCYL-Komponente zu untersuchen, haben wir Zeitraffermikroskopie und Fluoreszenz-Lifetime-Imaging-Mikroskopie (FLIM) von fluoreszierendem DABCYL-R10 durchgeführt, um die Auswirkungen auf den Zelleintritt durch die Bildung von Nukleationszonen (nucleation zones) zu bewerten. Darüber hinaus haben wir eine Struktur-Wirkungsstudie mit dreizehn an CPP gekoppelten DABCYL-Derivaten durchgeführt, um ihre Auswirkungen auf die Effizienz der Zellaufnahme zu untersuchen, wenn sie über Disulfidbindungen an Mono-Ub konjugiert sind. Unsere Ergebnisse zeigen, dass wir allein durch Strukturvariationen der DABCYL-Komponente bei nanomolarer Konzentration eine Verdreifachung der zytosolischen Aaufnahme von Ub erreichen konnten, was Studien zu verschiedenen intrazellulären Prozessen im Zusammenhang mit der Ub-Signalgebung ermöglicht.
It has come to the author's attention that an editing error resulted in an incorrect mass range shown in the baseline of the spectra in three figures in the Supporting Information (Figures S14-S16). A mistake in the HRMS data of compound D11 was also found. The revised Supporting Information file available online along with this Corrigendum corrects these errors. These corrections do not alter the conclusions of the published work.
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