Оптимізація Біотехнологічних Процедур Підготовки Сперми До Трансфекції Днк З Ліпофектаміном

Abstract

З метою аналізу впливу трансфекції з ліпофектаміном на запліднювальну здатність сперміїв качурів (Anas platyrhynchos Linnaeus, 1758) породи Shaoxing проведено аналіз яєць та ембріонів 11 качок породи Shaoxing, які були запліднені спермою 13 качурів, обробленою ліпофектаміном. Птиця відповідала стандарту породи Shaoxing. Качок у віці десяти місяців відбирали за умови їх несучості ≥ 90% та плодючості ≥ 90% після штучного осіменіння. Качурів відбирали зі стабільним рефлексом спермовіддачі при стимуляції методом масажу поперекової частини тулуба. Сперму збирали в конічні полістирольні чашки з подальшим розведенням до 1: 1 середовищем OPTI-MEM (Invitrogen, США) та транспортуванням до лабораторії (протягом 15–20 хвилин після збору) для оцінки якості та трансфекції сперми. Рухливість і концентрацію сперматозоїдів оцінювали за стандартними методиками під оптичним мікроскопом. Для трансфекції сперматозоїдів 300 мкл плазмідної ДНК (25 нг/мл кожного вектора) змішували з 1 мл середовища OPTI-MEM. Тим часом 300 мкл Lipofectamine® 2000 (Invitrogen, США) змішували з 1 мл середовища OPTI-MEM. Після того, як два розчини інкубували протягом 5 хвилин при кімнатній температурі, їх об'єднували та інкубували при кімнатній температурі ще 20 хвилин. Сперму двічі центрифугували (1000g, 10 хв), надосадову рідину видаляли і проводили розведення осаджених клітин сперми середовищем OPTI-MEM 1: 1. Комплекс ДНК-Lipofectamine® 2000 додавали до клітин сперми після другого центрифугування, та видалення надосадової рідини, потім його перемішували та інкубували при кімнатній температурі протягом години. Після трансфекції рухливість сперматозоїдів знову оцінювали для визначення якості сперми. Трансфіковані клітини сперми використовували для глибокого штучного запліднення. За одне запліднення було взято п’ятсот мільйонів сперматозоїдів. Після осіменіння качок трансфікованими сперматозоїдами яйця збирали і інкубували протягом 10 або 28 днів, потім виділяли ембріони або вирощували каченят. Для контролю впливу проведених маніпуляцій зі спермою під час проведення трансфекції на її запліднюючу здатність, експеримент побудували методом груп-аналогів, було відібрано 11 качок яких осіменяли інтактною спермою. В дослідній групі заплідненість становила 52,2±4,97%, що достовірно відрізнялось від групи контролю 84.1±5.83% (p < 0.01). Виводимість становила 47.18% (67 каченят з 142 запліднених яєць)