ИНСЕКТИЦИДНЫЕ СВОЙСТВА Bacillus thuringiensis var. israelensis. Сообщение II. СРАВНИТЕЛЬНЫЙ МОРФОЛОГИЧЕСКИЙ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ КРИСТАЛЛОГЕННЫХ И АКРИСТАЛЛОГЕННЫХ ШТАММОВ

Abstract

Бактерии Bacillus thuringiensis var. israelensis -основной агент биологической защиты от кровососущих двукрылых насекомых, многие из которых являются переносчиками трансмиссивных болезней сельскохозяйственных животных. Штаммы-продуценты для производства инсектицидных препаратов выделяют из природных объектов, получают посредством селекции ранее использованных изолятов, скрининга генетических коллекций и генной или геномной инженерии. При этом вопрос сохранности и контроля практически ценных свойств штаммов остается ключевым. Биопрепараты представляют существенный интерес в связи с их значительными преимуществами перед химическими пестицидами и рассматриваются в современных системах сельского хозяйства в качестве экологически и социально приоритетных альтернатив агрохимикатов. В представленной работе нами выполнен первый комплексный сравнительный анализ кристаллогенных и акристаллогенных вариантов Bacillus thuringiensis var. israelensis (BtH 14 ), выделенных после хранения штамма в разных режимах. У кристаллогенных вариантов методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) впервые выявлены гены, кодирующие целевые инсектицидные токсины -Cry4 и Сry11, и показано, что акристаллогенные формы этих генов лишены. Установлено, что у кристаллогенных вариантов культуральная жидкость приблизительно в 7000 раз активнее в отношении личинок Aedes aegypti чем у акристаллогнных. Целью настоящего исследования было сопоставление морфологических, биохимических, технологических, ларвицидных свойств кристаллогенных и акристаллогенных штаммов бактерии (BtH 14 ) и проверка наличия у них генов, кодирующих энтомоцидные токсины Сry, которые относятся к ключевым детерминантам вирулентности. Изучали штаммы 404, 87 (хранились 28 лет методом лиофилизации, затем 2 года в пробирках на скошенном рыбном агаре -РА с пересевом каждые 6 мес), штамм 7-1/23 (хранился 28 лет в кристаллах NaСl, затем 2 года в культуральной жидкости -КЖ при температуре 3 С). Культуры рассевали методом истощающегося мазка на РА в чашках Петри. На 7-е сут роста при 30 С отбирали кристаллогенные (404/14, 87/21, 7-1/23-4) и акристаллогенные (404/19, 87/33, 7-1/23-8) варианты методом световой микроскопии, используя краситель черный анилиновый. У вариантов не выявили различий по морфологии колоний на РА в чашках Петри: колонии были плоские, матовые, серовато-белые, шероховатые, округлые, структура мелкозернистая, консистенция вязкая. Изучение морфологии вегетативной культуры, основных биохимических свойств (образование ацетилметилкарбинола, лецитиназы, использование углеводов, расщепление крахмала и др.) и оценка титра на дрожже-полисахаридной среде также не показали различий. Продуктивность вариантов 404/14, 87/21, 7-1/23-4 и 404/19, 87/33, 7-1/23-8 была в пределах соответственно (3,36-4,02)½10 9 и (3,74-4,13)½10 9 КОЕ/мл. Ларвицидная активность кристаллогенных вариантов, которая выражалась в ЛК 50 для L 4 Aedes aegypti, составляла (0,12-0,16)½10  3 %, акристаллогенные варианты были неактивными в пределах следующих общепринятых разведений (½10  3 %): 1,0; 0,5; 0,25; 0,125 и 0,06...