Φυσιολογική διερεύνηση της σωματικής εμβρυογένεσης στη χαρουπιά (Ceratonia siliqua L)

Abstract

Η σωματική εμβρυογένεση είναι η διαδικασία με την οποία σωματικά κύτταρα, κάτω από κατάλληλες επαγωγικές συνθήκες, δημιουργούν εμβρυογενετικά κύτταρα, τα οποία υπόκεινται σε μια σειρά από μορφολογικές και βιοχημικές αλλαγές, που έχουν σαν αποτέλεσμα τη διαμόρφωση σωματικών εμβρύων. Τα σωματικά έμβρυα εμφανίζουν διπολική δομή, που περιλαμβάνει εμβρυϊκό άξονα ρίζας-βλαστού, με κλειστό, ανεξάρτητο αγγειακό σύστημα. Τα σωματικά έμβρυα μπορεί να δημιουργηθούν άμεσα επάνω στο έκφυτο (direct somatic embryogenesis) ή έμμεσα με σχηματισμό κάλλου (indirect somatic embryogenesis). Η σωματική εμβρυογένεση έχει τη βάση της στην ολοδυναμία των κυττάρων, ιδιότητα που έχουν μόνο τα ανώτερα φυτά. Οι συνθήκες επαγωγής περιλαμβάνουν το κατάλληλο θρεπτικό μέσο, τον κατάλληλο συνδυασμό φυτοαυξητικών ρυθμιστών, τη ρύθμιση της παροχής ή όχι φωτός, τον τρόπο τοποθέτησης του εκφύτου στο θρεπτικό μέσο. Τα σωματικά έμβρυα είναι εύκολο να υποστούν χειρισμούς, οι συνθήκες καλλιέργειάς τους μπορούν να ελεγχθούν και η έλλειψη υλικού δεν είναι περιοριστικός παράγοντας για τον πειραματισμό. Αυτά τα χαρακτηριστικά έχουν κάνει τη σωματική εμβρυογένεση ένα πρότυπο (μοντέλο) για τη μελέτη μορφολογικών, φυσιολογικών, μοριακών και βιοχημικών διεργασιών που συμβαίνουν κατά την έναρξη και την ανάπτυξη της εμβρυογένεσης στα ανώτερα φυτά. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή μελετήθηκαν έκφυτα χαρουπιάς (Ceratonia siliqua L.) στο εργαστήριο, που έδιναν εμβρυογενετικά κύτταρα και σωματικά έμβρυα. Επίσης μελετήθηκε ο τύπος του θρεπτικού μέσου, συνδυασμοί φυτοαυξητικών ρυθμιστών, παρουσία ή απουσία φωτός, συγκεντρώσεις σακχάρων και η επίδραση της θερμοκρασίας στην ανάπτυξη σωματικών εμβρύων. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι από τμήματα κοτυληδόνων και εμβρύων ώριμων σπερμάτων, από υποκοτύλια, ρίζες και νεαρούς βλαστούς που προέκυψαν από τη διόγκωση και βλάστηση των ώριμων σπερμάτων προέκυψαν κάλοι διαφόρων μορφών και μεγεθών. Σε ορισμένους από αυτούς τους κάλλους αναπτύχθηκαν βλαστοί και ρίζες και από αυτούς τους ιστούς με κατάλληλη κατεργασία αναπτύχθηκαν νεαρά φυτάρια χωρίς όμως δημιουργία σωματικών εμβρύων. Αυτό σημαίνει πως οι ιστοί από τα ώριμα σπέρματα ενώ διαθέτουν μορφογενετικό (ριζογενετικό και βλαστογενετικό) δυναμικό δεν διαθέτουν εμβρυογενετικό δυναμικό. Σε παλαιότερη εργασία με ώριμα σπέρματα χαρουπιάς φάνηκε μόνο η ικανότητα δημιουργίας κάλλου, χωρίς βλαστογενετικό και ριζογενετικό δυναμικό. Ενδεχομένως, οι διαφορές αυτές οφείλονται στις συνθήκες καλλιέργειας ή στο γενετικό υπόβαθρο των εκφύτων. Σε ένα δεύτερο στάδιο, χρησιμοποιήθηκαν ανώριμα σπέρματα χαρουπιάς με τις ίδιες καλλιεργητικές συνθήκες με εκείνες για τα ώριμα σπέρματα, για να διαπιστωθεί ο ρόλος της ηλικίας του εκφύτου στη δημιουργία εμβρυογενετικού δυναμικού. Αποδείχτηκε πως από τις κοτυληδόνες και το σώμα των ζυγωτικών εμβρύων των ανώριμων σπερμάτων προέκυπτε σωματική εμβρυογένεση έμμεση από εμβρυογενετικό κάλλο και άμεση κατευθείαν από το διογκωμένο ιστό. Παρατηρήθηκε, με προσθήκη της κυτοκινίνης ΒΑ, ανάπτυξη σωματικών εμβρύων. Απ’ ότι φαίνεται η παρουσία της ΒΑ μέχρι τη συγκέντρωση 10 μΜ είναι από μόνη της ικανή να επάγει σωματική εμβρυογένεση. Οι πολύ μικρές συγκεντρώσεις αυξίνης σε συνδυασμό με την ΒΑ ή διευκολύνουν τη σωματική εμβρυογένεση και μάλιστα την άμεση, ή είναι αδιάφορες. Τα ποσοστά σωματικών εμβρύων που αναπτύσσονται μόνο σε ΒΑ είναι μεγαλύτερα σε σχέση με αυτά που αναπτύσσονται στο συνδυασμό ΒΑ και αυξίνης. Από τις αυξίνες που χρησιμοποιήθηκαν, το ΝΑΑ οδήγησε σε ανάπτυξη ελάχιστων σωματικών εμβρύων σε συγκεντρώσεις μεγαλύτερες από αυτές της ΒΑ. Τα σωματικά έμβρυα που αναπτύσσονται μόνο σε ΒΑ είναι άμεσης εμβρυογένεσης και πολύ καλής ποιότητας, ενώ αυτά που αναπτύσσονται στο συνδυασμό των φυτοαυξητικών ρυθμιστών είναι λίγα και άμεσα ή έμμεσα, ανώμαλα με συντηγμένες κοτυληδόνες Όταν ο διογκωμένος ιστός πρόκειται να δώσει σωματικά έμβρυα, τότε εμφανίζει περιορισμένη καλλογένεση και βλαστογενέση.Σε ένα τρίτο στάδιο έγινε προσπάθεια να βελτιστοποιηθεί ποσοστιαία η σωματική εμβρυογένεση, να προσδιοριστεί με σχετική ακρίβεια η ηλικία των ανώριμων σπερμάτων που εμφάνιζαν τα περισσότερα και καλύτερης ποιότητας σωματικά έμβρυα, με μεγαλύτερη ικανότητα βλάστησης και ανάπτυξης φυταρίων. Προς αυτήν την κατεύθυνση έγινε συστηματική μηνιαία δειγματοληψία ανώριμων σπερμάτων πάντα από τα ίδια δέντρα της ίδιας περιοχής με αυτά από τα οποία είχε γίνει η λήψη των ώριμων σπερμάτων. Απεδείχθη ότι από τα πολύ ανώριμα σπέρματα όπως τις γονιμοποιημένες σπερματικές βλάστες δεν προέκυψε κάποια αντίδραση, εκτός από σπάνια καλλογένεση. Ολόκληρα ζυγωτικά έμβρυα από ανώριμα σπέρματα μήκους 1-3 mm που είχαν συλλεχθεί το Φεβρουάριο εμφανίζουν έντονη εμβρυογενετική ικανότητα, ακόμη και σε θρεπτικό μέσο χωρίς φυτοαυξητικούς ρυθμιστές, γεγονός που δεν έχει αναφερθεί στη μέχρι τώρα βιβλιογραφία. Από μισά ζυγωτικά έμβρυα από ανώριμα σπέρματα μήκους 4-5 mm που είχαν συλλεχθεί το Μάρτιο κομμένα στον οβελιαίο άξονα και τοποθετημένα με την απαξονική πλευρά τους σε θρεπτικό μέσο Μ.S. και με ποικιλία συγκεντρώσεων φυτοαυξητικών ρυθμιστών ΒΑ, καθώς και συνδυασμό ΒΑ με ΙΒΑ, ΝΑΑ, 2,4-D κυρίως σε σκοτάδι, προέκυψαν μεγάλα ποσοστά σωματικών εμβρύων φυσιολογικών αλλά και ανώμαλων. Αυτά τα σωματικά έμβρυα βλάστησαν, ριζοβόλησαν και αναπτύχθηκαν περαιτέρω σε μικρά φυτάρια σε θρεπτικό μέσο Μ.S., χωρίς φυτοαυξητικούς ρυθμιστές σε μεγάλο ποσοστό. Η επαγωγή σωματικών εμβρύων από ζυγωτικά έμβρυα και τις κοτυληδόνες τους, αυτού του μεγέθους σπερμάτων δεν είχε προηγουμένως αναφερθεί. Επιπλέον από σπέρματα που τοποθετήθηκαν σε μεγάλες συγκεντρώσεις ΒΑ για λίγες ώρες και τα οποία μεταφέρθηκαν σε ολοδύναμο ή ημιδύναμο θρεπτικό μέσο M.S. με ποικιλία σακχαρόζης, εμπλουτισμένο με διάφορες συγκεντρώσεις ΝΑΑ, 2,4-D και ΙΒΑ προέκυψε μεγάλο ποσοστό σωματικών εμβρύων. Επιπλέον, μεγάλο ποσοστό σωματικών εμβρύων επετεύχθη με τη μεταφορά κάλλων και διογκωμένων ιστών από διάφορες συγκεντρώσεις ΒΑ στο σκοτάδι κυρίως σε διάφορες συγκεντρώσεις αυξινών μετά την παρέλευση 40-50 ημερών. Από τους χειρισμούς με προηγούμενη παραμονή των εκφύτων για 15 περίπου ημέρες σε Μ.S. χωρίς φυτοαυξητικούς ρυθμιστές και η μετέπειτα καλλιέργειά τους σε θρεπτικό μέσο με φυτοαυξητικούς ρυθμιστές προέκυψαν πολύ μεγαλύτερα ποσοστά σωματικής εμβρυογένεσης. Από τμήματα εμβρύων και κοτυληδόνων, που απομονώθηκαν από πράσινα ανώριμα σπέρματα μήκους 5-8 mm που συλλέχτηκαν τον Απρίλιο προέκυψαν αξιόλογα ποσοστά σωματικής εμβρυογένεσης σε συνδυασμούς ΒΑ και ΙΒΑ, ενώ μικρότερα ποσοστά σε συνδυασμούς ΒΑ με ΝΑΑ, GA3 και 2,4-D. Γενικά σύμφωνα με τη βιβλιογραφία, η παρουσία της 2,4-D, φαινόταν ότι ήταν εντελώς ακατάλληλη. Τα πειράματα που έγιναν έδειξαν την σημαντική εμβρυογενετική δράση του συνδυασμού ΒΑ και 2,4-D. Καλλιέργεια σπερμάτων που είχαν υποστεί καταπόνηση ψύχους (4-6 οC) για χρονικό διάστημα 3 μηνών ευνόησε καλλογένεση, βλαστογένεση και ριζογένεση, όχι όμως και σωματική εμβρυογένεση. Αν και παλαιότερες εργασίες υπέθεταν ότι όλα τα φυτικά κύτταρα ήταν εξίσου ολοδύναμα, τα στοιχεία δείχνουν ότι μόνο ένα υποσύνολο των φυτικών κυττάρων μπορεί να μετατραπεί σε εμβρυογενετικά κύτταρα και μόνον ένα τμήμα αυτών μπορούν να εξελιχθούν σε έμβρυα. Σε τμήματα διογκωμένων εμβρύων, κοτυληδόνων, κάλλων από έμβρυα και κοτυληδόνες που είχαν προκύψει από καλλιέργεια ανώριμων σπερμάτων μήκους μεγαλύτερου των 8 mm αναπτύχθηκαν ανώμαλα σωματικά έμβρυα σε μικρό ποσοστό. Στην ηλικία αυτή των εκφύτων καθυστερεί η εμφάνιση σωματικής εμβρυογένεσης περισσότερο από 3 μήνες και το ποσοστό αυτών είναι πολύ μικρό σε σχέση με τα έκφυτα νεότερης ηλικίας. Ενδιαφέρον παρουσιάζει η ανάπτυξη πολλών άμεσων πρωτογενών σωματικών εμβρύων στις ρίζες που αναπτύχθηκαν από κάλο κοτυληδόνας που είχε δημιουργηθεί μετά από μεταφορά διογκωμένης κοτυληδόνας από 1 μΜ ΒΑ σε θρεπτικό μέσο M.S. και 1,25 μΜ ΝΑΑ, μετά από 40 περίπου ημέρες. Ανεξάρτητα από τον τρόπο δημιουργίας των σωματικών εμβρύων αυτά παρουσιάζουν μορφολογικές ανωμαλίες, όπως για παράδειγμα περισσότερες κοτυληδόνες από δύο ή και σύντηξη των κοτυληδόνων. Μερικά έμβρυα παρουσίασαν σχηματισμό οφθαλμών από τους οποίους αναπτύσσονται βλαστοί και διαφοροποιήθηκαν σε πολλαπλούς βλαστούς στο θρεπτικό μέσο χωρίς φυτοαυξητικούς ρυθμιστές.Σε ένα τέταρτο στάδιο αναπτύχθηκαν μικρά πλήρη φυτά από σωματικά έμβρυα που είχαν αποκτηθεί με ποικιλία καλλιεργητικών συνθηκών. Η καλύτερη ποιότητα φυταρίων προέκυψε από σωματικά έμβρυα που αναπτύχθηκαν μόνον παρουσία της ΒΑ. Επομένως η αρχική κατεργασία των εκφύτων παίζει σημαντικό ρόλο στη μετέπειτα ποιότητα των φυτών. Σε ένα πέμπτο στάδιο έγινε τρισδιάστατη απεικόνιση σωματικών εμβρύων και ριζών που είχαν προκύψει με τις παραπάνω καλλιεργητικές συνθήκες. Η βαθύτερη κατανόηση των μηχανισμών που διέπουν την αύξηση και την ανάπτυξη των φυτών απαιτεί ποσοτικά στοιχεία για την τρισδιάστατη μορφολογία και τη δραστηριότητα των γονιδίων σε διάφορα στάδια και κλίμακες. Η οπτική τομογραφία προβολής μπορεί να εφαρμόζεται σε μια ευρεία ποικιλία φυτικού υλικού και σε διαβάθμιση κλίμακας, συμπεριλαμβανομένων φυτών, φύλλων, ανθέων, ριζών, σπερμάτων, εμβρύων και μεριστωμάτων. Η οπτική τομογραφία προβολής είναι μια τεχνική που επιτρέπει την τρισδιάστατη απεικόνιση ενός βιολογικού δείγματος. Με το σύστημα αυτό είναι δυνατόν να προκύψουν ακριβή στατιστικά στοιχεία σχετικά με τη μορφολογία, θέσεις δομικών στοιχείων και περιοχών γονιδιακής έκφρασης σε διαφορετικά στάδια της ανάπτυξης. Η τεχνική μπορεί να προσφέρει ποσοτικά στοιχεία για την ανάλυση της σχέσης μεταξύ της ανάπτυξης και του σχηματισμού προτύπων. Με πειραματική συσκευή Οπτικής Τομογραφίας Προβολής και με χρήση λευκού φωτός, έγινε τρισδιάστατη απεικόνιση σωματικών εμβρύων και μικρών ριζιδίων χαρουπιάς. Συνοψίζοντας, φαίνεται πως η παρουσία μόνον της κυτοκινίνης ΒΑ σε συγκεντρώσεις 5 μΜ και 10 μΜ είναι ικανή να επάγει σωματική εμβρυογένεση σε ανώριμα σπέρματα μήκους 1-3 mm, ανώριμα σπέρματα μήκους 4-5 mm και κομμένα κατά μήκος, στο σώμα ζυγωτικών εμβρύων και στις κοτυληδόνες τους, που απομονώθηκαν από σπέρματα 5 mm. Τμήματα κοτυληδόνων και εμβρύων των παραπάνω εκφύτων έχουν μεγάλο εμβρυογενετικό δυναμικό σε Μ.S. χωρίς φυτοαυξητικούς ρυθμιστές και παράγουν σωματικά έμβρυα σε μεγάλο ποσοστό, καλής ποιότητας, έμμεσα και άμεσα, πρωτογενή και δευτερογενή, τα οποία αναπτύσσονται σε στάδιο κοτυληδόνων και δίνουν πλήρη φυτάρια με βλαστό και ρίζες σε πειραματικές συνθήκες (π.χ. στο σωλήνα καλλιέργειας). Παρουσία ΒΑ σε συνδυασμό με 2,4-D και ΙΒΑ προκύπτει διόγκωση και ρήξη ανώριμων σπερμάτων μήκους 1-3 mm και επάγεται σωματική εμβρυογένεση άμεση ακόμη και πάνω στο σώμα και τις κοτυληδόνες των ζυγωτικών εμβρύων. Με την παρουσία ΒΑ στο θρεπτικό μέσο, σε συνδυασμό με ΝΑΑ, 2,4-D, ΙΒΑ τόσο σε φωτοπερίοδο 16 h, όσο και σε σκοτάδι επάγεται σωματική εμβρυογένεση άμεση και έμμεση σε ανώριμα σπέρματα 4-5 mm κατά μήκος κομμένα. Τα σωματικά αυτά έμβρυα στην πλειονότητά τους αναπτύσσονται και βλαστάνουν με ταυτόχρονη δημιουργία ριζών σε Μ.S. χωρίς φυτοαυξητικούς ρυθμιστές και μικρά φυτάρια αναπτύσσονται στο σωλήνα καλλιέργειας. Η καταπόνηση με επαγωγή ΒΑ 100 μΜ ή 200 μΜ για 2-3 ώρες μισών σπερμάτων μήκους 4-5 mm ή μισών ζυγωτικών εμβρύων και των κοτυληδόνων τους κομμένων στον επιμήκη άξονα, από ανώριμα σπέρματα μήκους 5-8 mm ή των μισών ζυγωτικών εμβρύων και των κοτυληδόνων τους κομμένων σε τέσσερα τμήματα από ανώριμα σπέρματα μήκους μεγαλύτερου των 8 mm και η καλλιέργειά τους στη συνέχεια σε διάφορες συγκεντρώσεις από ΝΑΑ, 2,4-D, ΙΒΑ και GA3, επάγει σωματική εμβρυογένεση. Η παρουσία μόνον των αυξινών ΝΑΑ, 2,4-D, ΙΒΑ και GA3 χωρίς προηγούμενη παραμονή σε ΒΑ δεν μπορεί να δημιουργήσει εμβρυογενετικό δυναμικό, με ελάχιστες εξαιρέσεις και, σε μικρό ποσοστό. Η παραμονή σε Μ.S., χωρίς φυτοαυξητικούς ρυθμιστές, επάγει σωματική εμβρυογένεση σε μικρό ποσοστό στα ανώριμα σπέρματα μήκους 1-3 mm καθώς και στα μισά σπέρματα μήκους 4-5 mm. Σε αυτή τη φάση ανάπτυξης των σπερμάτων, τα ζυγωτικά έμβρυα και οι κοτυληδόνες έχουν μεγάλο εμβρυογενετικό δυναμικό. Η ικανότητα ανάπτυξης σωματικών εμβρύων ελαττώνεται, όσο αυξάνεται η ηλικία των ανώριμων σπερμάτων. Τα έμβρυα, οι κοτυληδόνες, τα υποκοτύλια των ώριμων σπερμάτων δεν έχουν εμβρυογενετικό δυναμικό αλλά διατηρούν ικανότητα καλλογένεσης, καταβολών, βλαστογένεσης και ριζογένεσης. Ο χρόνος εφαρμογής και η παρουσία ΒΑ στην καλλιέργεια είναι σημαντικοί παράγοντες επαγωγής σωματικής εμβρυογένεσης. Η καλλιέργεια τμημάτων ζυγωτικών εμβρύων και κοτυληδόνων από ανώριμα σπέρματα μήκους μεγαλύτερου των 8 mm σε θρεπτικό μέσο Μ.S. με αυξίνες (ΝΑΑ, 2,4-D, ΙΒΑ και GA3) σε διαβάθμιση συγκεντρώσεων και η μεταφορά των κάλλων και των διογκωμένων εκφύτων σε θρεπτικό μέσο Μ.S. με κυτοκινίνη ΒΑ σε διαβάθμιση συγκεντρώσεων ευνόησε έντονη βλαστογένεση σε μεγάλο ποσοστό και δεν ευνόησε τη σωματική εμβρυογένεση. Αναπτύχθηκαν άμεσα σωματικά έμβρυα στις ρίζες που δημιουργήθηκαν από κάλο κοτυληδόνων.