Πρωτεΐνες Που Ρυθμίζουν Τα Επίπεδα Και Τις Λειτουργίες Της HDL

Abstract

Πολυάριθμες επιδημιολογικές και γενετικές μελέτες καθώς και μελέτες σε μοντέλα ζώωνέχουν δείξει ότι HDL έχει έναν μεγάλο αριθμό λειτουργιών που μπορεί να συμβάλουν στηνπροστασία από την καρδιαγγειακή νόσο. Ο μεταβολισμός της HDL είναι μια σύνθετηδιαδικασία και περιλαμβάνει τη δράση πρωτεϊνών της κυτταρική μεμβράνης καθώς καιπρωτεϊνών του πλάσματος. Στη διατριβή αυτή περιγράφονται πειράματα που διερευνούν τομονοπάτι του σχηματισμού της HDL χρησιμοποιώντας γονιδιακή μεταφορά μέσω αδενοϊών σεδιάφορα ζωικά μοντέλα ποντικο. Πιό συγκεκριμένα μελετήσαμε τα εξής:1. Τη σημασία των υδρόφοβων αμινοξέων στην περιοχή 218-230 της apoA-I στοσχηματισμό της HDL.2. Την επίδραση μεταλλάξεων στην LCAT στο σχηματισμό της HDL.3. Την επίδραση του ενζύμου CTα στο σχηματισμό της HDL.4. Η συμβολή των επικρατουσών μεταλλάξεων της apoE στην ομοιόσταση των λιπιδίων και στο σχηματισμό της HDL.5. Η σύμπραξη της apoA-IV και της LCAT στο σχηματισμό της HDL που περιέχει apoA-IV.6. Η επίδραση της HDL που περιέχει apoE ή apoA-I στην έκφραση γονιδίων τωνενδοθηλιακών κυττάρων. Η σημασία των υδρόφοβων αμινοξέων στην περιοχή 218-230 της apoA-I στο σχηματισμότης HDLΜελετήσαμε τη σημασία των υδρόφοβων αμινοξέων στο καρβοξυτελικό άκρο τηςapoA-I στη δομή και τις λειτουργίες της καθώς και τη συμβολή τους στο σχηματισμό της HDL.Συγκεκριμένα, εισαγάγαμε τρία σετ σημειακών μεταλλάξεων στην περιοχή 218-230 της apoA-I,αντικαθιστώντας τα υδρόφοβα αμινοξέα με Αλανίνες. Γονιδιακή μεταφορά μέσω αδενοϊώντης μεταλλαγμένης μορφής apoA-I[L218A/L219A/V221A/L222A] σε apoA-I-/- ποντίκια μείωσετη χοληστερόλη του πλάσματος και τα επίπεδα της apoA-I στο 15% σε σ χέση μ ε τ ην α γρίουτύπου apoA-I και οδήγησε στι σχηματισμό preβ και α4 HDL. Στα apoA-I-/- x apoE-/- ποντίκια ηίδια μετάλλαξη οδήγησε στο σχηματισμό δισκοειδών σωματιδίων HDL και preβ HDL που δενμπορούν να μετατραπούν σε ώριμους α-HDL υποπληθυσμούς με υπερέκφραση της LCAT. Γονιδιακή μεταφορά μέσω αδενοϊών της μεταλλαγμένης μορφής apoAI[F225Α/V227A/F229A/L230A] σε apoA-I-/- ποντίκια μείωσε τη χοληστερόλη του πλάσματος, τηχοληστερόλη της HDL και τα επίπεδα της apoA-I. Όταν αυτη η μεταλλαγμένη μορφής της apoAIεκφράστηκε σε apoA-I-/- x apoE-/- ποντίκια, περίπου το 40% της μεταλλαγμένης apoA-I καθώςεπίσης η ποντικίσια apoΑ-IV και apoB-48 εντοπίστηκε στα κλάσματα των VLDL/IDL/LDL. Και σταδύο μοντέλα ποντικιών, η apoA-I[F225Α/V227A/F229A/L230A] οδήγησε στο σχηματισμόμικρών σφαιρικών preβ κ αι α 4-HDL σωματιδίων. Συνέκφραση της apoAI[F225Α/V227A/F229A/L230A] και της LCAT αύξησε και μετατόπισε την καμπύλη τηςχοληστερόλη της HDL προς τα κλάσματα χαμηλότερης πυκνότητας, και οδήγησε στοσχηματισμό των φυσιολογικών υποπληθυσμών της HDL. Οι μεταλλάξεις apoA-I[218-222] καιapoA-I[225-230] είχαν το 20% και 31% αντίστοιχα της ικανότητας της αγρίου τύπου apoA-I να προάγουν την εκροή χοληστερόλη μέσω της ABCA1. Επίσης και οι δύο μεταλλάξεις είχαν το~65% της ικανότητας της αγρίου τύπου apoA-I να ενεργοποιήσουν την LCAT in vitro. Οιβιοφυσικές αναλύσεις έδειξαν ότι και οι δύο μεταλλάξεις είχαν επιπτώσεις στη δομή και τηνπλαστικότητα της apoA-I που είναι απαραίτητη για τις κανονικές της λειτουργίες. Γονιδιακήμεταφορά μέσω αδενοϊών της μεταλλαγμένης μορφής apoAI[L218A/L219A/V221A/L222A/F225Α/V227A/F229A/L230A] σε apoA-I-/- ποντίκια δημιούργησεπαρόμοιο φαινότυπο με την apoA-I[L218A/L219A/V221A/L222A] ο οποίος δεν μπορούσε ναδιορθωθεί με την υπερέκφραση της LCAT. Συμπερασματικά, η αλλαγή των υδρόφοβωναμινοξέων στη περιοχή 218-222 της apoA-I διαταράσσει την αλληλεπίδραση μεταξύ της apoΑ-Iκαι της ABCA1 και οδηγεί στο σχηματισμό ελαττωματικών preβ υποπληθυσμών πουαποτυγχάνουν να ωριμάσουν σε ώριμη α-HDL με αποτέλεσμα τα χαμηλά επίπεδα της apoA-Iκαι της HDL στο πλάσμα. Οι μεταλλάξεις των υδρόφοβων αμινοξέων στην περιοχή 225-230 της apoΑ-I επίσης εμπόδισαν τη βιογένεση της HDL και οδήγησαν στη συσσώρευση ανώριμωνpreβ κ αι α 4-HDL υποπληθυσμών μόρια, ένας φαινότυπος που μπορεί ν α δ ιορθωθεί μ ε τ ηνυπερέκφραση της LCAT.Η επίδραση των μεταλλαγών της LCAT και της υπερέκφρασης της CTα στη βιογένση της HDLΜελετήσαμε την επίδραση της υπερέκφρασης του ενζύμου cytidylyltransferaseCTP:phosphocholine (CTα) καθώς επίσης και μεταλλάξεων της LCAT στη βιογένεση της HDL σεδιάφορα μοντέλα ποντικών. Γονιδιακή μεταφορά μέσω αδενοϊών της apoA-I μαζί με την CΤασε apoA-I-/- ποντίκια αύξησε τη χοληστερόλη του πλάσματος, τα επίπεδα των φωσφολιπιδίων,τους μεγάλου μεγέθους α1-HDL υποπληθυσμούς και οδήγησε στη διαμόρφωση σφαιρικώνσωματιδίων HDL. Γονιδιακή μεταφορά μέσω αδενοϊών της αγρίου τύπου LCAT σε LCAT-/- ποντίκια αύξησε πολύ τα συνολικά επίπεδα χοληστερόλης πλάσματος που οφείλονται κυρίωςστην αύξηση στη χοληστερόλη της HDL. Αντίθετα η γονιδιακή μεταφορά μέσω αδενοϊών τηςLCAT που φέρει τις φυσικές μεταλλαξεις LCAT[T123Ι] και LCAT[P250S] επηρέασε σε μικρότεροβαθμό τα επίπεδα της χοληστερόλης του πλάσματος. Κλασμάτωση του πλάσματος μευπερφυγοκέντριση σε διαβάθμιση KBr έδειξε ότι η αγρίου τύπου LCAT αύξησε τα επίπεδα τηςapoE και apoA-IV του πλάσματος και μετατόπισε την apoA-I στα κλάσματα χαμηλότερηςπυκνότητας. Οι μεταλλάξεις LCAT[T123Ι] και LCAT[P250S] αποκατέστησαν μερικώς τηνπαρουσία της apoA-I στα κλάσματα της HDL2/HDL3 και στην περίπτωση της μετάλλαξηςLCAT[T123Ι] αύξησε την apoE στα κλασματα της VLD/IDL/LDL. Τα LCAT-/- ποντίκια σχγματίζουνδύο υποπληθυσμούς preβ HDL και έναν α4-HDL. Οι μεταλλάξεις LCAT[T123Ι] και LCAT[P250S]παρήγαγαν preβ και α4,α3,α2-HDL υποπληθυσμούς ενώ η αγρίου τύπου LCAT παρήγαγε μόνοα-HDL μεγάλου μεγέθους. Συνέκφραση της apoA-I[L159R]Fin ή της apoA-I[225-230] με την LCAT αποκατέστησε τον ελαττωματικό φαινότυπο της HDL που δημιουργούν οι μεταλλάξειςapoA-I[L159R]Fin και apoA-I[225-230]. Αντίθετα, η συνέκφραση οποιασδήποτε από τιςμεταλλάξεις LCAT[T123Ι] και LCAT[P250S] είτε με την apoA-I[L159R]Fin ή την apoA-I[225-230]δεν αποκατήστησε πλήρως το φαινότυπο της HDL. Συμπέρασματικά η υπερέκφραση της CΤακαι της LCAT προάγει τη βιογένεση της HDL ενώ οι μεταλλάξεις στην LCAT επιδρούν αρνητικάστην βιογένεση της HDL. Η συμβολή επικρατουσών μεταλλάξεων της apoE στην ομοιόσταση των λιπιδίων και στηνβιογένεση της HDLΟι σημειακές μεταλλάξεις K146N/R147W στην ανθρώπινη apoΕ3 περιγράφηκαν για πρώτηφορά σε ασθενείς με μια κυρίαρχη μορφή της υπερλιποπρωτεϊναιμίας τύπου III. Οι επιδράσειςτων μεταλλάξεων αυτών στις in νίνο λειτουργίες της apoE μελετήθηκαν με γονιδιακήμεταφορά μέσω αδενοϊών των apoE3[K146N/R147W] και apoE3[K146N/R147W]-202 σεδιάφορα μοντέλα ποντικών. Η έκφραση της apoE3[K146N/R147W] σε χαμηλά επίπεδα σεapoE-/- ή apoA-I-/- x apoE-/- ποντίκια επιδείνωσε την υπερχοληστερολαιμία και αύξησεσημαντικά την συγκέντρωση της apoE και των τριγλυκεριδίων. Στα apoE-/- ποντίκια ημετταλεγμένη μορφή apoE3[K146N/R147W] εκτόπισε την aροΑ-Ι από όλα τα κλάσματα τωνVLDL/LDL/HDL και οδήγησε στη συσσώρευση στο πλάσμα δισκοειδών σωματιδίων HDL που περιέχουν apoE. Παρόμοιες δόσεις αγρίου τύπου apoE3 σε apoE-/- ποντίκια οδήγησαν στοκαθαρισμό της χοληστερόλης από το πλάσμα, χωρίς την επαγωγή υπερτριγλυκεριδαιμίας, καιστον σχηματισμό σφαιρικών σωματιδίων HDL. Ένα μοναδικό χαρακτηριστικό τηςμεταλλαγμένης μορφής apoE3[K146N/R147W]-202 είναι ότι εμπόδισε την επαγωγήυπερτριγλυκεριδαιμίας, αλλά δεν διόρθωσε την υπερχοληστερολαιμία. Συνέκφραση τηςapoE3[K146N/R147W] και της LPL σε apoE-/- ποντίκια διόρθωσε την υπερτριγλυκεριδαιμία, αλλάδεν εμπόδισε τον σχηματισμό της δισκοειδούς HDL. Συνέκφραση της apoE3[K146N/R147W]και της LCAT επίσης διόρθωσε την υπερτριγλυκεριδαιμία, τα επίπεδα των εστέρων τηςχοληστερόλης του πλάσματος και οδήγησε στη παραγωγή σφαιρικής HDL. Συμπερασματικά, οιαντικαταστάσεις K146N/R147W αποτρέπουν τον καθαρισμό της χοληστερόλης, επιδεινώνουν την δυσλιπιδαιμία και επηρεάζουν την λειτουργία της LCΑT αναστέλλοντας έτσι την βιογένεσητης HDL .Η σύμπραξη της apoΑ-IV και της LCAT στη βιογένεση της HDL που περιέχει apoΑ-IVΜελετήσαμε τη συμβολή LCAT στη βιογένεση της HDL που περιέχει apoΑ-IV. Γονιδιακήμεταφορά μέσω αδενοϊών της apoΑ-IV σε LCAT-/- ποντίκια απέτυχε να σχηματίσει HDL.Μεταφορά της apoΑ-IV σε apoA-I-/- ποντίκια δεν επηρέασε τα επίπεδα των λιπιδίων τουπλάσματος ενώ η apoΑ-IV εντοπιστηκε στα κλάσματα της HDL3. Συνέκφραση της apoΑ-IV καιτης LCAT σε apoA-I-/- ποντίκια αποκατέστησε το σχηματισμό της HDL που περιέχει apoΑ-IV. Τααποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η apoΑ-IV μπορεί να σχηματίσει μοναδικους πληθυσμούςHDL που περιέχουν apoA-IV με τη συμμετοχή της LCAT, και δίνουν μια πιθανή εξηγήση για τιςαντιφλεγμονώδεις και αθηρωπροστατευτικές ιδιότητες της apoΑ-IV. Η επίδραση της τεχνητής HDL που περιέχει apoE και apoA-I στην γονιδιακή έκφραση τωνενδοθηλιακών κυττάρωνΠροκαταρτικά πειράματα μικροσυστοιχιών RNA από ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα τηςαορτής μετά από την έκθεσή τους σε τεχνητή HDL που περιέχει apoA-I [χρησιμοποιώνταςφωσφολιπίδια και χοληστερόλη (rHDLAI+) ή μόνο φωσφολιπίδια (rHDLAI-)] ή apoE (rHDLE+ καιrHDL-). Οι αναλύσεις βιοπληροφορικής έδειξαν ότι η rHDLAI– και η rHDLAI+ προκάλεσαν τηδιαφορική έκφραση σε 137 και 190 γονίδια αντίστοιχα. Ομοίως στην περίπτωση των rHDLE3-και rHDLE3+ παρατηρήθηκαν διαφορές σε 198 και 272 γονίδια αντίστοιχα. Οι μικροσυστοιχίεςRNA επιβεβαιώθηκαν με qΡRT-PCR. Χρησιμοποιώντας το λογισμικό IPA analysis καθώς και εκτεταμένη έρευνα στη βιβλιογραφία σχηματίσαμε προτακαρτικά σηματοδοτικά μονοπάτιαστα οποία συμμετέχουν τα διαφορικά εκφραζόμενα γονίδια που εντοπίστηκαν.