Προσδιορισμός γονοτύπου HPV ιού ατο δέρμα των παιδιών με τη μοριακή τεχνική άμεσης ανάλυσης αλληλουχιών DNA (direct sequencing analysis)

Abstract

Ο ανθρώπινος ιός των θηλωμάτων (Human Papilloma Virus, HPV) είναι ένας DNA ιός που προσβάλλει τα κύτταρα της βασικής στιβάδας της επιδερμίδας και τα επιθηλιακά κύτταρα. Το γονιδίωμά του ενσωματώνεται στο γονιδίωμα αυτών των κυττάρων και τα εκτρέπει σε πολλαπλασιασμό. Έχουν ταυτοποιηθεί μέχρι σήμερα περισσότεροι από 150 γονότυποι του HPV ιού. Ορισμένοι έχουν ιδιαίτερη σημασία διότι προκαλούν βλάβες που μπορεί να καταλήξουν σε καρκίνο. Ο ιός του θηλώματος του ανθρώπου HPV στην παιδική ηλικία έχει ενοχοποιηθεί για μια σειρά από καλοήθεις αλλοιώσεις σε διάφορες ανατομικές θέσεις, με συχνότερη εκδήλωση τα θηλώματα του δέρματος. Η κλινική βλάβη που προκαλεί ο ανθρώπινος ιός των θηλωμάτων στο δέρμα ονομάζεται μυρμηκιά. Ανάλογα με την κλινική τους εικόνα ή την εντόπισή τους, οι μυρμηκιές διακρίνονται σε κοινές, νηματοειδείς, ομαλές, περιονυχικές, υπονυχικές, παλαμών και πελμάτων. Η επίπτωσή τους είναι μεγαλύτερη στις ηλικίες 12 έως 16 έτη και στα κορίτσια σε σχέση με τα αγόρια. Στο 40% των παιδιών τα δερματικά θηλώματα υποχωρούν χωρίς θεραπεία. Σε ορισμένες περιπτώσεις λόγω της ανατομικής τους θέσης μπορούν να προκαλέσουν πόνο στο παιδί, γεγονός που απαιτεί τη θεραπευτική τους αντιμετώπιση.Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν να διερευνηθεί η τυχόν παρουσία του ιού HPV σε δείγματα μυρμηκιάς σε παιδιά, ώστε να συσχετιστεί η παρουσία του ιού με τη νόσο. Στη μελέτη συμμετείχαν 84 παιδιά ηλικίας έως 18 ετών με διαγνωσμένες μυρμηκιές. Η συμμετοχή στη μελέτη περιλάμβανε τη συμπλήρωση ερωτηματολογίου που περιείχε πληροφορίες σχετικές με οικογενειακό και ατομικό ιστορικό. Όσον αφορά το ερωτηματολόγιο ατομικού ιστορικού περιείχε πληροφορίες για το ιστορικό υγείας δερματικού νοσήματος, τις ατομικές συνήθειες (κολυμβητήριο, γυμναστήριο), τα κλινικά ευρήματα και τον τύπο της βλάβης. Το ερωτηματολόγιο του οικογενειακού ιστορικού αφορούσε την καταγραφή δερματικών νοσημάτων στην οικογένεια. Με την έγγραφη συγκατάθεση των γονιών των παιδιών που συμμετείχαν στη μελέτη συλλέχθηκε ξέσμα από την περιοχή της βλάβης από το οποίο απομονώθηκε γενετικό υλικό του ιού HPV προκειμένου να γίνει η ταυτοποίηση.Για να προσδιοριστεί ο τύπος του ιού του HPV στα δείγματα μυρμηκιάς χρησιμοποιήθηκαν τρεις διαφορετικές μεθοδολογίες σε συνδυασμό και προς επιβεβαίωση των αποτελεσμάτων. Αρχικά πολλαπλασιάστηκε το DNA του ιού με την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR). Στη συνέχεια το προϊόν της αντίδρασης υπέστη :a)Κατάτμηση με περιοριστικές ενδονουκλεάσες (πέψη) με την οποία συγκεκριμένος τύπος HPV δημιουργεί στο πήκτωμα αγαρόζης συγκεκριμένο πρότυπο ζωνών.b)Αλληλούχιση της πρωτοδιάταξης DNA (Sequencing) όπου με τη βοήθεια του λογισμικού BLAST τυποποιήθηκε ο τύπος του ιού.Ωστόσο σε κάποιες περιπτώσεις λόγω πολλαπλής λοίμωξης ή μη γνωστού προτύπου ζωνών για το πήκτωμα δεν ήταν δυνατός ο προσδιορισμός του τύπου. Σε αυτές τις περιπτώσεις αλλά και για το μεγαλύτερο μέρος των δειγμάτων έγινε ειδικός σχεδιασμός μικροσφαιριδίων για την ανάλυση με την τεχνολογία Luminex. Μετά τον προσδιορισμό των τύπων του ιού του HPV που ανιχνεύθηκαν στα υπό εξέταση δείγματα, πραγματοποιήθηκε στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων με το πρόγραμμα SPSS. Αυτό είχε ως στόχο τη συσχέτιση της συχνότητας εμφάνισης, του τύπου του HPV με τα δεδομένα που συλλέχθησαν από τα ερωτηματολόγια (ηλικία, ιστορικό μόλυνσης, συνήθειες κτλ.). Από τις παραπάνω συσχετίσεις φάνηκε ότι ο επικρατέστερος τύπος μυρμηκιάς στα παιδιά είναι οι κοινές και οι παλαμών-πελμάτων, ενώ εμφανίζονται σε μεγαλύτερα ποσοστά στις επιφάνειες του σώματος που έρχονται σε επαφή με το εξωτερικό περιβάλλον. Επιπλέον έγινε μια συγκριτική μελέτη των μεθόδων που χρησιμοποιήθηκαν για την τυποποίηση του ιού. Από τη σύγκριση αυτή προέκυψε ότι η μέθοδος Luminex υπερισχύει σε σχέση με τη μέθοδο πέψης με περιοριστικές ενδονουκλεάσες, ενώ η μέθοδος ανάλυσης της αλληλουχίας (sequencing) παραμένει η μέθοδος επιβεβαίωσης του αποτελέσματος.Τέλος τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης συσχετίστηκαν με δεδομένα από την υπάρχουσα βιβλιογραφία προκειμένου να διερευνηθεί αν υπάρχει ομοιογένεια με παρόμοιες μελέτες. Έτσι τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης συμβαδίζουν με αυτά της διεθνούς βιβλιογραφίας όσον αφορά τους συχνότερους τύπους HPV (HPV 57) που ανιχνεύονται στο γενικό πληθυσμό στις μυρμηκιές. Η ανεύρεση του τύπου HPV 16 στις κοινές μυρμηκιές, σε ποσοστό 33%, είναι εύρημα ιδιαίτερης σημασίας δεδομένου ότι ο τύπος αυτός απαντά σε λοιμώξεις και νεοπλασίες του δέρματος και των βλεννογόνων της περιγεννητικής και της περιπρωκτικής περιοχής. Μελλοντικές έρευνες σε μεγαλύτερο αριθμό δειγμάτων μυρμηκιάς θα οδηγήσουν σε καλύτερη κατανόηση της δράσης και του τρόπου αντιμετώπισης του ιού HPV.