Ο ρόλος των microRNAs και της πρωτεΐνης RhoB στην ιική μόλυνση από τον ανθρώπινο κυτταρομεγαλοϊό

Abstract

Ο ανθρώπινος κυτταρομεγαλοϊός (ο ιός HCMV, human cytomegalovirus), ένας πολύ διαδεδομένος ερπητοϊός, είναι ένα σημαντικό παθογόνο και προκαλεί σοβαρά νοσήματα στους ανοσοκατεσταλμένους και στα νεογνά με συγγενή νόσο. Η πρωτεΐνη RhoB ανήκει στην οικογένεια των Rho GTPασών, η οποία ρυθμίζει ποικίλες κυτταρικές διεργασίες. Οι πρωτεΐνες Rho εμπλέκονται στην είσοδο και την έξοδο από το κύτταρο, κυρίως των α- και γ- ερπητοϊών, ενώ οι β-ερπητοϊοί είναι οι λιγότερο μελετημένοι ως προς αυτό το θέμα. Στην παρούσα μελέτη, διερευνήθηκε ο ρόλος της RhoB GTPασης κατά τη διάρκεια της λυτικής μόλυνσης του ιού HCMV. Ανάλυση μικροσκοπίας, τόσο σε μονιμοποιημένα όσο και σε ζωντανά κύτταρα κατέδειξε ότι η πρωτεΐνη RhoB μετατοπίστηκε στο κυτταροπλασματικό διαμέρισμα συναρμολόγησης του ιού HCMV (assembly complex/ assembly compartment, AC), μία κυτταροπλασματική περιοχή στα μολυσμένα κύτταρα όπου πολλές ιικές δομικές πρωτεΐνες είναι γνωστό ότι αθροίζονται και πραγματοποιείται η συναρμολόγηση νέων ιοσωματίων. Επιπλέον, η πρωτεΐνη RhoB εντοπίστηκε στο AC ακόμη κι όταν η έκφραση των όψιμων ιικών πρωτεϊνών ανεστάλη. Στα πολύ όψιμα στάδια της μόλυνσης, σχηματίστηκαν κυτταρικές προσεκβολές οι οποίες περιείχαν την πρωτεΐνη RhoB και ιοσωμάτια του ιού HCMV, φαινόμενο που πιθανόν συνεισφέρει στην επιτυχή ιική διασπορά. Παρουσιάζει ενδιαφέρον ότι η καταστολή της έκφρασης της πρωτεΐνης RhoB στα μολυσμένα από τον ιό HCMV κύτταρα είχε ως αποτέλεσμα τη σημαντική μείωση του ιικού τίτλου και μπορούσε επίσης να επηρεάσει την άθροιση στο AC των εντοπιζόμενων στο συγκεκριμένο κυτταρικό διαμέρισμα ιικών πρωτεϊνών. Η καταστολή της έκφρασης της πρωτεΐνης RhoB επηρέασε επίσης τη δομή των ινιδίων ακτίνης. Παρατηρήθηκε αναδιοργάνωση των ινιδίων ακτίνης στα όψιμα στάδια της μόλυνσης, η οποία εκπορευόταν από το ιικό AC και περιέβαλε επίσης τις κυτταρικές προσεκβολές, υποδηλώνοντας μια πιθανή αλληλεπίδραση μεταξύ της πρωτεΐνης RhoB και της ακτίνης κατά τη διάρκεια της συναρμολόγησης και της εξόδου του ιού HCMV. Τέλος, αναγνωρίστηκαν και άλλες Rho πρωτεΐνες, οι οποίες εντοπίζονται στο AC του ιού HCMV, το οποίο παρουσιάζει μια ιδαίτερη διαμόρφωση ανάμεσα σε γειτονικά κύτταρα. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης καταδεικνύουν για πρώτη φορά ότι η πρωτεΐνη RhoB είναι ένα συστατικό του ιικού AC και είναι αναγκαία για την παραγωγική μόλυνση του ιού HCMV, καθώς επίσης και ότι και άλλες Rho πρωτεΐνες εμπλέκονται στα όψιμα στάδια της λυτικής μόλυνσης του ιού HCMV. Τα microRNAs (miRNAs) είναι μικρά μόρια RNA τα οποία βάσει της συμπληρωματικότητάς τους με τα mRNAs, προσδένονται σε αυτά και επηρεάζουν, συνηθέστερα αρνητικά, την έκφρασή τους. Τα miRNAs εκφράζονται σε πολλούς οργανισμούς, όπως στα φυτά, στον άνθρωπο και σε πολλούς ιούς, συμπεριλαμβανομένου του ιού HCMV. Τα κυτταρικά και τα ιικά miRNAs μπορούν να ρυθμίσουν τόσο κυτταρικά όσο και ιικά γονίδια, και με τους τρόπους αυτούς να επηρεάσουν την πορεία της μόλυνσης. Στην παρούσα μελέτη διερευνήθηκε η επίδραση του ιού HCMV στην έκφραση των κυτταρικών miRNAs καθ' όλη τη διάρκεια της λυτικής μόλυνσης του ιού σε ανθρώπινους ινοβλάστες. Με μικροσυστοιχίες miRNAs, αναγνωρίστηκαν 26 κυτταρικά miRNAs, των οποίων η έκφραση μεταβλήθηκε σημαντικά. Από τα miRNAs που μεταβλήθηκαν, τα 14 παρουσίασαν αύξηση και διαχωρίστηκαν περαιτέρω σε τέσσερις ομάδες βάσει του χρονικού προτύπου της μεταβολής τους, και τα 12 εκδήλωσαν μείωση της έκφρασης και διαχωρίστηκαν σε τρεις περαιτέρω ομάδες. Από τα 26 miRNAs που επηρέασε ο ιός HCMV, τα 8 είχαν πολύ σημαντική επίδραση στην εξέλιξη της λυτικής μόλυνσης του ιού, καθώς η αναστροφή της προκαλούμενης από τον ιό μεταβολής της έκφρασής τους, είχε ως αποτέλεσμα τη σημαντική μείωση του παραγώμενου ιού. Τα συγκεκριμένα 8 κυτταρικά miRNAs μελετήθηκαν περαιτέρω και με προγράμματα βιοπληροφορικής αναγνωρίστηκαν οι πιθανοί κυτταρικοί στόχοι τους. Από αυτούς επιλέχθηκαν οι επικρατέστεροι στόχοι και στη συνέχεια αυτές οι προβλέψεις επαληθεύτηκαν με πειράματα ενεργότητας λουσιφεράσης και αναλύσεις πολυμεράσης πραγματικού χρόνου (Real-Time PCR). Τα miRNAs και οι στόχοι τους συσχετίσθηκαν σε δύο δίκτυα, στα οποία παρατηρήθηκε συντονισμένη χρονικά μεταβολή της έκφρασης των miRNAs και των mRNAs των στόχων τους. Στο πρώτο δίκτυο, το δίκτυο της φλεγμονής συμπεριελήφθησαν 3 miRNAs και στο δεύτερο δίκτυο, το δίκτυο χρωματίνης, συμπεριελήφθησαν τα υπόλοιπα 5 miRNAs. Τα δύα αυτά δίκτυα φαίνεται ότι διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην έκβαση της μόλυνσης, καθώς η απορρύθμιση ακόμη και μεμεονωμένων miRNAs που μετέχουν σε αυτά, επηρέασε αρνητικά την έκφραση πολλών ιικών γονιδίων και προκάλεσε μείωση του παραγώμενου ιού.