Μελέτης της εποχιακής κατανομής των ειδών Phlebotomus που απαντώνται στην Κρήτη και του ρόλου τους στη μετάδοση του πρωτόζωου παράσιτου Leishmania, και μελέτη της διατήρησης της επίκτητης αντοχής του παράσιτου στα φάρμακα μέσα στους ξενιστές του

Abstract

Η φλεβοτόμος, είναι ο διαβιβαστής του πρωτοζώου Leishmania που προκαλεί λεϊσμανίαση. Η ανακάλυψη αυτή έγινε στην Ελλάδα το 1910, σχεδόν μια δεκαετία από τη χρήση της ονομασίας Leishmania. Η εξάπλωση των φλεβοτόμων καλύπτει και τις πέντε ηπείρους και καλύπτει τροπικές και υποτροπικές περιοχές, ενώ κάποια είδη τα βρίσκουμε και σε πιο εύκρατα κλίματα. Η συνεχώς αυξανόμενη μέση θερμοκρασία της γης προκαλεί ανησυχία γιατί νέες περιοχές θα γίνουν φιλόξενες για τις φλεβοτόμους. Εκτός από τους ορεινούς όγκους, οι κλιματολογικές συνθήκες είναι οι μόνες που περιορίζουν την εξάπλωσή τους στη χέρσο. Ενδεικτικά σημεία στα οποία μπορούν να ξεκουραστούν και να αναπαραχθούν, είναι μικρές σχισμές σε βράχους ή τοίχους, σπηλιές ή και κουφάλες δέντρων, αλλά και περιοχές με έντονη βλάστηση, περιττώματα ζώων και φυλλοστρωμνή. Από τα 31 είδη του γένους Phlebotomus που παίζουν το ρόλο του διαβιβαστή της Leishmania, μεγαλύτερο υγειονομικό ενδιαφέρον στην Ελλάδα παρουσιάζουν τα είδη Phlebotomus (Larroussius) tobbi, Phlebotomus (Paraphlebotomus) sergenti, Phlebotomus (Paraphlebotomus) papatasi, Phlebotomus (Larroussius) perniciosus, Phlebotomus (Larroussius) neglectus καθώς και ο πιθανός αλλά όχι εξακριβωμένος διαβιβαστής Phlebotomus (Paraphlebotomus) similis. Στην Κρήτη το Phlebotomus neglectus μεταδίδει τη Leihsmania infantum, η οποία προκαλεί σπλαχνική λεϊσμανίαση στον άνθρωπο και στο σκύλο. Το Phlebotomus similis ενοχοποιείται ως ο διαβιβαστής της Leishmania tropica, που προκαλεί τη δερματική λεϊσμανίαση, λόγω της υψηλής του συγγένειας με το Phlebotomus sergenti που είναι ο γνωστός διαβιβαστής της Leishmania tropica. Δεδομένης της συνεχόμενης αύξησης των κρουσμάτων στη χώρα μας και ειδικά στην Κρήτη, καθίσταται αναγκαία η εμπεριστατωμένη γνώση πάνω στην οικολογία των φλεβοτόμων που μεταδίδουν λεϊσμανίαση. Η λεϊσμανίαση είναι μια ασθένεια που προκαλείται από το πρωτόζωο παράσιτο του γένους Leishmania και προσβάλλει τόσο τα θηλαστικά, όσο και τα ερπετά. Η φλεβοτόμος είναι ο κύριος διαβιβαστής της. Συναντάται σε τρεις μορφές, τη σπλαχνική, τη δερματική και τη βλεννοδερματική λεϊσμανίαση. Κάθε χρόνο καταγράφονται περίπου 0,7 - 1 εκατομμύριο νέα περιστατικά λεϊσμανίασης σε 98 χώρες με το ποσοστό θνησιμότητας να αγγίζει το 3,3%. Στην Ελλάδα τα συμπτώματά της είναι γνωστά πριν ακόμη της δοθεί το όνομα «λεϊσμανίαση». Τα τελευταία χρόνια έχει παρουσιαστεί αύξηση των κρουσμάτων στη χώρα μας και ειδικά στην Κρήτη. Η ανάπτυξη επίκτητης αντοχής της Leishmania σε μία ομάδα φαρμάκων, που επάγεται από την ανάπτυξη αντοχής σε ένα μόνο φάρμακο (φαινότυπος MDR), είναι το πιο σημαντικό χαρακτηριστικό της. Είναι ένα παράσιτο με εξαιρετική πλαστικότητα στο γονιδίωμα και χαρακτηρίζεται κυρίως από ανευπλοειδία. Πληθυσμιακά μπορεί να μεταλλάσσεται σε πολύ σύντομο χρονικό διάστημα είτε σε επίπεδο γονιδίου, είτε σε επίπεδο χρωμοσώματος. Παρ’ ότι στη φαρέτρα έναντι της νόσου προστίθενται συνεχώς νέα φάρμακα, είναι πολύ σημαντικό να γνωρίζουμε εάν ο MDR φαινότυπος που αποκτά το παράσιτο παραμένει στις εναλλαγές του κύκλου ζωής του (αμαστιγωτή – προμαστιγωτή μορφή), ή χάνεται. Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η μελέτη της εποχιακής κατανομής των ειδών Phlebotomus που απαντώνται στην Κρήτη, ώστε να συλλεχθούν σημαντικά δεδομένα σε σχέση με τον ρόλο τους στη μετάδοση του πρωτόζωου παράσιτου Leishmania. Έπειτα, η διερεύνηση της διατήρησης ή μη, της αντοχής των παρασίτων μετά την ολοκλήρωση του κύκλου ζωής τους μέσα από τον κάθε ξενιστή (θηλαστικό – φλεβοτόμος). Επίσης, η δημιουργία ανθεκτικών παρασίτων με τη χρήση του σκευάσματος Glucantime® και στις δύο μορφές του κύκλου ζωής τους, μέσα και έξω από τον ξενιστή και η διερεύνηση της διατήρησης ή μη, της επίκτητης αντοχής που θα έχουν αποκτήσει. Το μέρος που επιλέχθηκε για τη διεξαγωγή της μελέτης της εποχιακής κατανομής των ειδών Phlebotomus που απαντώνται στην Κρήτη, ήταν το χωριό Φόδελε, στο οποίο είχαν παρουσιαστεί κρούσματα λεϊσμανίασης στο παρελθόν. Η συλλογή των φλεβοτόμων έγινε με τη χρήση CDC Miniature Light Traps (John W. Hock Co., Gainesville, FL, USA) και Sticky Traps για τρεις συνεχόμενες ημέρες στα μέσα κάθε μήνα επί τρία συναπτά έτη. Η περίοδος δειγματοληψίας κάλυπτε όλη τη χρονική περίοδο που οι φλεβοτόμοι παρέμεναν ενεργές. Το πρώτο έτος, οι δειγματοληψίες δεν ήταν δυνατό να ξεκινήσουν πριν τον Ιούνιο. Για τη συλλογή των περιβαλλοντικών δεδομένων χρησιμοποιήθηκαν δέκα καταμετρητές θερμοκρασίας, σχετικής υγρασίας και σημείου δρόσου, καθώς και ένα ανεμόμετρο. Λοιποί περιβαλλοντικοί παράγοντες, όπως υετός και φάση σελήνης, καταγράφονταν επίσης. Για τη μελέτη της διατήρησης της επίκτητης αντοχής του παράσιτου στα φάρμακα, επιλέχθηκαν πέντε ανθεκτικά και πέντε ευαίσθητα στελέχη Leishmania infantum που είχαν χαρακτηριστεί ως προς την ανθεκτικότητά τους στο εργαστήριό μας στο παρελθόν με τη χρήση της κυτταρομετρίας ροής. Το μέγεθος που ορίζει την αντοχή τους ονομάζεται «slope α» και μετράει το ρυθμό εκροής του φαρμάκου σε χρονικά διάστημα δύο ωρών. Η αντοχή των δέκα στελεχών μετρήθηκε ξανά όταν αποψύχθηκαν. Στη συνέχεια ενοφθαλμίστηκαν σε ποντίκια και με το πέρας 15 ημερών, αυτά θανατώθηκαν και καλλιεργήθηκε ο σπλήνας και το ήπαρ τους, ώστε να απομονωθούν ξανά τα παράσιτα. Αυτά μετρήθηκαν ξανά και στη συνέχεια ένα από αυτά επιλέχθηκε για την επαγωγή της αντοχής και την ολοκλήρωση του δεύτερου μέρους του πειράματος. Η επαγωγή της αντοχής εφαρμόστηκε στην προμαστιγωτή μορφή σε καλλιέργεια παρασίτων, καθώς και στην αμαστιγωτή μορφή μέσα στην ανθρώπινη κυτταρική σειρά THP-1 και ποντίκια τύπου Rag1-, με τη χρήση του σκευάσματος Glucantime®. Χρήση της φλεβοτόμου στο συγκεκριμένο πείραμα δεν έγινε γιατί πραγματοποιήθηκε στην πορεία από άλλη ερευνητική ομάδα. Η προσπάθεια επαγωγής της αντοχής στην προμαστιγωτή φάση στην καλλιέργεια δεν επιτεύχθηκε.Από το σύνολο των 6.000 περίπου φλεβοτόμων που συλλέχθηκαν (60% αρσενικά, 40% θηλυκά), αναγνωρίστηκαν τα είδη Phlebotomus neglectus (57,8%), Phlebotomus similis (30,4%), Phlebotomus papatasi (2,5%), Phlebotomus simici (0,1%), Sergentomyia minuta (8,8%), καθώς και το νέο-αναγνωρισθέν Phlebotomus (Adlerius) creticus n. sp. (0,4%). Το Phlebotomus neglectus ήταν το κυρίαρχο είδος, με το Phlebotomus similis να ακολουθεί, εκτός από την πρώτη χρονιά δειγματοληψίας. Τα δύο κυρίαρχα, καθώς και το Sergentomyia minuta, εμφανίστηκαν ολόκληρη τη δειγματοληπτική περίοδο. Η μελέτη της εποχιακής διακύμανσης των δύο κυρίαρχων δείχνει πως το Phlebotomus neglectus εμφάνισε δύο διακριτές πληθυσμιακές εκρήξεις (Μάιο και Αύγουστο), ενώ το Phlebotomus similis εμφάνισε μια διακριτή με μια λιγότερη διακριτή πληθυσμιακή έκρηξη να έπεται ή να προηγείται (Ιούνιο και Ιούλιο). Αρσενικά και θηλυκά παρουσίασαν παρόμοιο πρότυπο. Οι πληθυσμιακές τους εκρήξεις κουμπώνουν σαν παζλ, καθιστώντας όλους τους καλοκαιρινούς μήνες υψηλού υγειονομικού ενδιαφέροντος. Οι τιμές θερμοκρασίας και σχετικής υγρασίας που εμφάνισαν κορυφή τα δύο είδη ήταν Τ = 20,3οC – 27ο C, RH = 57,5% – 63,1% για το Phlebotomus neglectus και Τ = 24,3οC – 27,2ο C, RH = 53,9% – 59,1% για το Phlebotomus similis. Το εύρος θερμοκρασίας και υγρασίας που παρέμειναν ενεργά είναι σχεδόν το ίδιο με το Sergentomyia minuta, αλλά πολύ πιο διευρυμένο από τα υπόλοιπα είδη. Σε αυτό το είδος αρσενικά και θηλυκά παρουσίασαν διαφορετικό πρότυπο εποχιακής διακύμανσης. Η θερμοκρασία ήταν αυτή που σηματοδότησε την έναρξη της περιόδου ενεργοποίησης των φλεβοτόμων και ήταν ≥ 17 – 18οC για το Phlebotomus neglectus, ενώ ≥ 20 – 22οC για τα Phlebotomus similis και Sergentomyia minuta. Η αύξηση της θερμοκρασίας (r = 0,776, p < 0,05) και η μείωση της σχετικής υγρασίας (r = 0,644, p < 0,05), επηρέασαν θετικά μέχρι κάποιο βαθμό την αφθονία των φλεβοτόμων. Τα Phlebotomus neglectus και Phlebotomus similis επέδειξαν παρόμοιες οικολογικές προτιμήσεις, καλύπτοντας ολόκληρη την περιοχή μελέτης και συλλέχθηκαν και από τους δύο τύπους παγίδων. Η πλειονότητα των ατόμων όμως συλλέχθηκε από τις τύπου CDC και κυρίως από αυτές που ήταν στημένες κοντά σε περιοχές που λειτουργούσαν ως κοτέτσι και κουνελώνας και χαρακτηρίζονταν από έντονη βλάστηση. Στο έδαφος υπήρχαν περιττώματα αυτών των ζώων, καθώς και σάπια φρούτα και λαχανικά. Το Phlebotomus papatasi συλλέχθηκε σε μεγαλύτερο ποσοστό από τη μία από τις περιοχές που λειτουργούσαν ως κοτέτσι και κουνελώνας, αλλά και από τις παγίδες ST. Το Sergentomyia minuta συλλέχθηκε κυρίως από τις παγίδες ST (78%). Ένα μεγάλο ποσοστό θηλυκών Phlebotomus papatasi (29,9%) και Phlebotomus similis (23,2%) και ένα λίγο μικρότερο Phlebotomus neglectus (17,1%) και Sergentomyia minuta (15,6%) βρέθηκαν σε διάφορες φάσεις πέψης του γεύματός τους, καθώς και με αυγά. Τα πιο συχνά παρασιτούμενα είδη από ακάρεα ήταν το Phlebotomus similis (50% των παρασιτούμενων ατόμων) και το Phlebotomus neglectus (41% των παρασιτούμενων ατόμων), ενώ το πιο έντονα παρασιτούμενο ήταν το Phlebotomus papatasi με πάνω από 20 αποτυπώματα. Τέλος, στην κοιλιακή χώρα θηλυκού Phlebotomus neglectus παρατηρήθηκε νηματώδης σκώληκας. Όσον αφορά το πείραμα της αντοχής, το 70% των στελεχών που αποψύχθηκαν, εμφάνισαν αυξημένη αντοχή μετά την απόψυξη από την τράπεζα του εργαστηρίου, σε σχέση με αυτή που είχαν επιδείξει πριν καταψυχθούν. Το 20% εμφάνισε μειωμένη αντοχή, ενώ το 10% εμφάνισε την ίδια αντοχή προ- και μετά κατάψυξης. Όλα τα ευαίσθητα στελέχη παρουσίασαν αυξημένη αντοχή. Όταν τα δέκα στελέχη απομονώθηκαν από τα ποντίκια τύπου Rag1-, σχεδόν το 100% που ανακτήθηκε, προήλθε από τον σπλήνα. Το νωρίτερο που χρειάστηκε για την εμφάνιση των πρώτων παρασίτων στην καλλιέργεια ήταν 3 ημέρες και το αργότερο 14, ενώ ο μέσος όρος ήταν 6 ημέρες. Όταν αυτά τα στελέχη μετρήθηκαν ξανά με κυτταρομετρία ροής, το 70% παρουσίασε μειωμένη αντοχή, ενώ το 30% παρουσίασε αυξημένη αντοχή. Σε όλα τα ανθεκτικά στελέχη η αντοχή μειώθηκε. Στη συνέχεια επιλέχθηκε ένα στέλεχος, στο οποίο έγινε επαγωγή της αντοχής με το σκεύασμα Glucantime®. Αυτό ξεκίνησε ως ευαίσθητο, όταν απομονώθηκε για πρώτη φορά και σταδιακά έγινε ανθεκτικό μέχρι να χρησιμοποιηθεί στο πείραμα της αντοχής. Τα παράσιτα που ανακτήθηκαν από τα κύτταρα THP-1, φαίνεται πως έγιναν πιο ευαίσθητα σε σχέση με το αρχικό στέλεχος, είτε εφαρμόστηκε σε αυτά Glucantime®, είτε όχι. Σε αυτά που εφαρμόστηκε Glucantime® η βεραπαμίλη μπλόκαρε τη δράση των αντλιών και εμφάνισαν χαμηλότερη τιμή «slope β». Όσον αφορά την τιμή FVI, αυτά στα οποία δεν εφαρμόστηκε Glucantime® (THP-1_C) απορρόφησαν στατιστικά σημαντικά μικρότερη ποσότητα Rhod-123 σε σχέση με το αρχικό στέλεχος, είτε προστέθηκε βεραπαμίλη, είτε όχι (α < 0,05). Τέλος, παρατηρήθηκε πολύ ισχυρή μονοτονική συσχέτιση (|r| ≥ 0,8) μεταξύ της FVI και του slope, τόσο σε αυτά που εφαρμόστηκε Glucantime® (THP-1_C), όσο και σε αυτά που δεν εφαρμόστηκε (THP-1_G) (α < 0,05). Στα παράσιτα που ανακτήθηκαν από τα ποντίκια τύπου Rag1-, η αντοχή μειώθηκε σε σχέση με το αρχικό όταν δεν εφαρμόστηκε Glucantime® (Rag1_NGAI), ενώ αυξήθηκε όταν εφαρμόστηκε Glucantime® (Rag1_GAI). Όσον αφορά την τιμή FVI, στατιστικά σημαντική διαφορά παρατηρήθηκε μεταξύ αυτών στα οποία εφαρμόστηκε και αυτών στα οποία δεν εφαρμόστηκε Glucantime® (α < 0,05).Η κατανομή της φλεβοτόμου στην Ευρώπη τα επόμενα πενήντα χρόνια, αναμένεται να διευρυνθεί προς όλες τις κατευθύνσεις και να αυξηθεί η περίοδος που τα ενήλικα άτομα παραμένουν ενεργά. Η χρονική και γεωγραφική αλληλεπικάλυψη των ειδών που μεταδίδουν λεϊσμανίαση στην Κρήτη, έχει ιδιαίτερη σημασία, αφού τα κρούσματα αυξάνονται συνεχώς. Η χρονική κατανομή τους είναι από τις μεγαλύτερες γύρω από τη Μεσογειακή Λεκάνη. Η ύπαρξη του Phlebotomus papatasi δεν προβληματίζει όσον αφορά τη μετάδοση της λεϊσμανίασης γιατί λείπουν τα είδη που αποτελούν τη φυσική δεξαμενή του παρασίτου που μεταδίδει (Leishmania major), αλλά ευθύνεται για τη μετάδοση φλεβοϊών. Το Φόδελε, με τον έντονο αγροτικό του χαρακτήρα, προσφέρει πολλά σημεία για καταφύγιο και αναπαραγωγή στις φλεβοτόμους. Η πρόληψη που θα περιλαμβάνει ψεκασμούς, προστασία του σκύλου που αποτελεί τη φυσική δεξαμενή του παρασίτου και σωστή ενημέρωση, είναι απαραίτητη για την προστασία της δημόσιας υγείας. Η αντιμετώπισή των φλεβοτόμων πρέπει να λαμβάνει χώρα τους μήνες πριν εμφανίσουν πληθυσμιακή έκρηξη με γνώμονα τα σημεία που προτιμούν για ξεκούραση και αναπαραγωγή, λαμβάνοντας υπόψη ότι τα δύο πρώτα εμφανίζουν διαφορετικές οικολογικές προτιμήσεις και πιο ανθρωπόφιλο χαρακτήρα από το τελευταίο. Η χρήση των διαθέσιμων εμβολίων και των διάφορων εντομοαπωθητικών στους σκύλους, όπως και η ορολογική εξέταση στην αρχή και το τέλος της περιόδου ενεργοποίησης των φλεβοτόμων, ενδείκνυνται για την πρόληψη της λεϊσμανίασης. Η χρήση των φαρμάκων θα πρέπει να γίνεται με σωστό τρόπο. Αυτό σημαίνει πως αν ξεκινήσει θεραπεία, θα πρέπει να ολοκληρώνεται. Η Leishmania παρουσιάζει μεγάλη πλαστικότητα στο γονιδίωμά της με την ανευπλοϊδία να είναι ο κανόνας. Τα εργαστηριακά στελέχη για να ανταπεξέλθουν στο καινούριο περιβάλλον, υπόκεινται σε μεταλλάξεις που μπορούν να αλλάξουν ακόμη και τον καρυότυπό τους. Η αντοχή τους στα φάρμακα μπορεί να μεταβληθεί μέσα από τον κύκλο ψύξης – απόψυξης, καθώς και αν συνεχίσουν τον κύκλο ζωής τους μέσα από τον θηλαστικό ξενιστή. Κάθε δραστική ουσία που χρησιμοποιείται για την αντιμετώπιση του παρασίτου, προκαλεί γενετικές αλλαγές που επιτρέπουν στον επιστημονικό κόσμο να βρίσκει γονίδια – στόχους, η απουσία των οποίων μειώνει την αντοχή τους μόνο στη συγκεκριμένη δραστική ουσία. Η πολυπλοκότητα και η μεταβλητότητα του γενετικού υλικού της Leishmania αποκαλύπτει το λόγο που τα περισσότερα φάρμακα στοχεύουν ακόμη στο σύστημα των αντλιών που εισρέουν και εκρέουν το φάρμακο, αφού είναι πιο σταθερό. Στα πειράματα αντοχής πρέπει να λαμβάνονται υπόψη δύο μεγέθη. Ο ρυθμός εκροής του φαρμάκου (slope α) που καθορίζεται από τις αντλίες εκροής, καθώς και η ποσότητα που απορροφάει το παράσιτο τη χρονική στιγμή μηδέν (FVI), που καθορίζεται από τις αντλίες εισροής. Η συνδυαστική δράση τους θα καθορίσει πόση ποσότητα φαρμάκου θα μείνει μέσα στο παράσιτο και για πόσο χρόνο, που έχει μεγάλη σημασία, αφού το φάρμακο είναι κυτταροτοξικό. Ο οργανισμός μοντέλο που πρέπει να χρησιμοποιείται είναι το θηλαστικό (στην παρούσα έρευνα ανοσοκατασταλμένα ποντίκια), γιατί προσομοιάζει καλύτερα τον κύκλο ζωής του παρασίτου στη φύση. Από τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής φαίνεται πως η Leishmania αντέδρασε διαφορετικά μέσα στα ποντίκια και φάνηκε η σπουδαιότητα να χρησιμοποιούνται τα φάρμακα με σωστό τρόπο. Από την παρούσα διατριβή φάνηκε πως η θερμοκρασία παίζει τον πρωταρχικό ρόλο για την έναρξη της περιόδου ενεργοποίησης των φλεβοτόμων και είναι ξεχωριστή για κάθε είδος, ενώ η σχετική υγρασία σχετίζεται περισσότερο με την αφθονία τους. Βρέθηκε πως υπάρχει συγκεκριμένο πρότυπο με διακριτές πληθυσμιακές εκρήξεις για κάθε ένα από τα είδη που παρουσιάζουν ιατρικό ενδιαφέρον, ενώ ανακαλύφθηκε ακόμη ένα είδος το οποίο συγγενεύει με το Phlebotomus balcanicus που είναι γνωστός διαβιβαστής της Leishmania infantum. Επίσης έγινε ξεκάθαρο ότι τα οικόσιτα ζώα (κουνέλια, πουλερικά) πρέπει να τοποθετηθούν σε μεγαλύτερη απόσταση από τα σπίτια των ανθρώπων. Από την άλλη, φάνηκε ότι τα παράσιτα που εμφανίζουν μεγαλύτερη αντοχή, απορροφούν και μεγαλύτερη ποσότητα φαρμάκου από τα ευαίσθητα. Τόσο ο κύκλος ψύξης – απόψυξης, όσο και το πέρασμα μέσα από τον ξενιστή (κύτταρα THP-1, ποντίκια τύπου Rag1-), μπορούν να επηρεάσουν την αντοχή του παρασίτου. Ο καλύτερος οργανισμός μοντέλο στα πειράματα αντοχής είναι το θηλαστικό. Μέσα στα θηλαστικά φάνηκε ότι τα παράσιτα απόκτησαν μεγαλύτερη αντοχή από το αρχικό στέλεχος, απαντώντας θετικά στο ερώτημα της διατριβής: η αντοχή που θα αποκτηθεί μέσα στον θηλαστικό ξενιστή, θα διατηρηθεί όταν η Leishmania συνεχίσει τον κύκλο ζωής της.