Μελέτη φυσιολογικών χαρακτηριστικών στελεχών του μικροοργανισμού Listeria monocytogenes απομονωθέντων από γαλακτοκομικές επιχειρήσεις

Abstract

Υψηλό ποσοστό των θανατηφόρων κρουσμάτων παγκοσμίως, που σχετίζονται με την κατανάλωση γαλακτοκομικών προϊόντων, οφείλονται στον παθογόνο μικροοργανισμό Listeria monocytogenes. Στόχο της διατριβής αποτέλεσε η μελέτη της συμπεριφοράς απομονωμένων από τυροκομεία στελεχών της L. monocytogenes σε γαλακτοκομικά προϊόντα και σε συνθήκες που απαντώνται στο περιβάλλον μιας γαλακτοβιομηχανίας ή ενός τυροκομείου κατά την παραγωγική διαδικασία. Αρχικά, πραγματοποιήθηκε έρευνα για την εκτίμηση της υγιεινολογικής κατάστασης των προϊόντων και των επιφανειών παραγωγής Ελληνικών τυροκομείων μεσαίας κλίμακας και του επιπολασμού της L. monocytogenes. Οι υψηλοί πληθυσμοί των μικροοργανισμών δεικτών που μετρήθηκαν, έδειξαν την ανάγκη βελτίωσης των διαδικασιών που ακολουθούνται από τις επιχειρήσεις κατά την παραγωγή προϊόντων και την εξυγίανση των επιφανειών. Ο επιπολασμός των παθογόνων μικροοργανισμών (L. monocytogenes, Salmonella spp, S. aureus και E. coli 0157:H7) βρέθηκε χαμηλός. Με σκοπό την προσομοίωση σεναρίων μεταφοράς του παθογόνου μικροοργανισμού (επιμόλυνση) από τις επιφάνειες επεξεργασίας στα τρόφιμα και το αντίθετο, έλαβαν χώρα πειράματα σχηματισμού, αποκόλλησης βιοϋμενίων της L. monocytogenes και κινητικής τους σε γάλα, κρέμα και γιαούρτι στους 5 και 20oC. Ως βέλτιστη θερμοκρασία σχηματισμού βιοϋμενίων αποδείχθηκαν οι 20oC και ως ευνοϊκότερα για μικροβιακή ανάπτυξη υποστρώματα το γάλα και η κρέμα. Στο γιαούρτι δεν σχηματίστηκαν μετρήσιμα βιοϋμένια, ωστόσο όταν μεταφέρθηκαν κουπόνια από το γιαούρτι σε φρέσκο γάλα και κρέμα παρατηρήθηκε εκούσια αποκόλληση κυττάρων και ανάπτυξη του παθογόνου. Σε πειράματα θερμικής επεξεργασίας και χημικής απολύμανσης βιοϋμενικών και πλαγκτονικών κύτταρων της L. monocytogenes με διαφορετική φυσιολογική κατάσταση παρατηρήθηκε διαφορετική ικανότητα επιβίωσης του παθογόνου, ανάλογα με το είδος και τον χρόνο εφαρμογής του απολυμαντικού, τις συνθήκες σχηματισμού των βιοϋμενίων (pH, aw, T, χρόνος) και το είδος των κυττάρων. Στη συνέχεια, μελετήθηκαν οι συνθήκες που επιτρέπουν την αύξηση προσκολλημένων, αποκολλημένων και πλαγκτονικών κυττάρων της L. monocytogenes σε περίπτωση που αυτός βρεθεί σε υγρό θρεπτικό μέσο, γάλα και φρέσκο τυρί. Βρέθηκε ότι τα πλαγκτονικά κύτταρα πολλαπλασιάζονται ταχύτερα και έχουν υψηλότερη πιθανότητα ανάπτυξης σε δυσμενείς συνθήκες και χαμηλά επίπεδα επιμόλυνσης, σε σχέση με τα αποκολλημένα και τα προσκολλημένα κύτταρα. Επιπλέον, παρατηρήθηκε ότι τα όρια ανάπτυξης σε φρέσκο τυρί και σε γάλα ήταν μετατοπισμένα προς τις άριστες συνθήκες σε σχέση με αυτά σε υγρού μέσου (TSBYE). Η χρήση τροφίμων με διαφορετικά ρεολογικά χαρακτηριστικά, οδήγησε σε ακριβέστερη περιγραφή της πιθανότητας ανάπτυξης της L. monocytogenes. Ακολούθως, μελετήθηκε η κινητική ανάπτυξης του πληθυσμού της L. monocytogenes σε συνθήκες προσομοίωσης μιας διασταυρούμενης επιμόλυνσης στο περιβάλλον ενός τυροκομείου, μέσω της μεταφοράς του μικροοργανισμού σε υποστρώματα με διαφορετικές τιμές pH ή aw. Ο μέγιστος ειδικός ρυθμός ανάπτυξης προσαρμόστηκε άμεσα στο νέο περιβάλλον, ανεξάρτητα από την προϊστορία των κυττάρων. Αντίθετα, η φάση προσαρμογής του παθογόνου επηρεάστηκε τόσο από την διεύθυνση όσο και από το εύρος των μεταβολών, ιδιαιτέρα στις μεταβολές αλατότητας. Με την τροποποίηση του κλασσικού μοντέλου Baranyi βάση των αποτελεσμάτων, ώστε να περιλαμβάνει τόσο την μεταβολή της φυσιολογικής κατάστασης των κυττάρων (Q) σε καταστάσεις μη ανάπτυξης, όσο και το έργο προσαρμογής τους σε νέο περιβάλλον με συνθήκες που υποστηρίζουν την ανάπτυξη του μικροβίου, προβλέφτηκε με ακρίβεια η συμπεριφορά του παθογόνου κατά την διάρκεια δυναμικών συνθηκών οξύτητας ή αλατότητας σε γάλα. Από τα αποτελέσματα προέκυψε ότι κατά την επιβίωση του παθογόνου σε συνθήκες μη ανάπτυξης, λαμβάνουν χώρα διεργασίες προσαρμογής ή τραυματισμού σε επίπεδο κυττάρου, οι οποίες επηρεάζουν την συμπεριφορά του όταν βρεθεί εκ νέου σε περιβάλλον ανάπτυξης, μέσω διασταυρούμενης επιμόλυνσης των τροφίμων. Τέλος, με βάση τη γνώση που αποχτήθηκε από τα προηγούμενα πειράματα, μελετήθηκε η συμπεριφορά στελεχών της L. monocytogenes με διαφορετική φυσιολογία, όταν αυτά βρεθούν σε παστεριωμένο γάλα, τυρόπηγμα και νωπό τυρί, κατά τη διάρκεια τυροκόμησης και ωρίμασης Φέτας και Γραβιέρας. Πρωτίστως το στάδιο επιμόλυνσης και δευτερευόντως η τεχνολογία παρασκευής επηρέασαν σημαντικά την πιθανότητα ανάπτυξης και την κινητική του παθογόνου στα δύο τυριά. Σημαντικό ρόλο στην τεχνολογία της Γραβιέρας διαδραμάτισε η αναθέρμανση του πήγματος, αποτρέποντας την ανάπτυξη του μικροοργανισμού κατά τα πρώτα στάδια της τυροκόμησης. Η φυσιολογία των κυττάρων, όπως διαμορφώθηκε από την έκθεσή τους σε υποθανάτιες ή θανατηφόρες συνθήκες αλατότητας και οξύτητας, ανάλογα με το στάδιο της τυροκόμησης που έλαβε χώρα ο ενοφθαλμισμός, καθόρισε την κινητική τους. Από τα αποτελέσματα προέκυψε ότι απαιτείται μεγαλύτερη προσοχή στα πρώτα στάδια της τυροκόμησης, καθώς η επιμόλυνση των προϊόντων ακόμα και με χαμηλούς πληθυσμούς της L. monocytogenes, μπορεί να οδηγήσει στην παραγωγή τυριών με υψηλούς πληθυσμούς του παθογόνου. Συμπερασματικά, η γνώση της συμπεριφοράς της L. monocytogenes κατά μήκος της γραμμής παραγωγής και διάθεσης των γαλακτοκομικών προϊόντων μπορεί να βοηθήσει στην ορθότερη αποτίμηση της επικινδυνότητάς τους και την ευκολότερη διερεύνηση των πηγών επιμόλυνσης κατά τις επιδημιολογικές μελέτες.