Μελέτη των μηχανισμών του stress σε πρωτογενείς καλλιέργειες και Hsp70 - διαγονιδιακών ποντικών

Abstract

Η HSP70, η πιο σημαντική πρωτεΐνη θερμικού σοκ, αποτελεί έναν από τους δημοφιλέστερους μοριακούς συνοδούς και επάγεται στα κύτταρα μετά από έκθεσή τους σε διάφορα φυσικά ή χημικά περιβαλλοντικά ερεθίσματα, ενώ εμπλέκεται άμεσα ή έμμεσα σε πολλά βασικά κυτταρικά μονοπάτια. Σκοπός της παρούσας εργασίας, αρχικά, ήταν η διερεύνηση της προστατευτικής επίδρασης της πρωτεΐνης Hsp70 στην καρδιακή δυσλειτουργία, που επάγεται από τη δοξορουβικίνη (DOX), ένα σημαντικό αντικαρκινικό φάρμακο που αποτελεί ένα δυνητικό παράγοντα πρόκλησης καρδιακής ανεπάρκειας, καθώς και οι μηχανισμοί δράσης της, σε αγρίου τύπου ποντίκια (F1/F1) και διαγονιδιακά ποντίκια (Tg/Tg), που υπερεκφράζουν την ανθρώπινη Hsp70. Η εκτίμηση της καρδιακής λειτουργίας in vivo με διαθωρακική ηχοκαρδιογραφία και η ανάλυση των καρδιακών δεικτών μετά από χρόνια χορήγηση δοξορουβικίνης, έδειξαν πως η μείωση της συστολικής λειτουργίας της αριστερής κοιλίας εξασθενεί στα Tg/Tg ποντίκια και ότι η υπερέκφραση της Hsp70 συνεισέφερε στην προστασία του μυοκαρδίου των πειραματοζώων ενάντια στη δοξορουβικίνη. Σε πρωτεϊνικά εκχυλίσματα από το μυοκάρδιο των ίδιων ποντικιών με επαγόμενη από δοξορουβικίνη καρδιακή ανεπάρκεια, παρατηρήθηκε η επαγωγή της αποπτωτικής διαδικασίας, μέσω της ενεργοποίησης του καταρράκτη των κασπασών. Η υπερέκφραση της Hsp70 στα διαγονιδιακά Tg/Tg ποντίκια παρείχε προστασία ενάντια στη βλάβη του μυοκαρδίου μέσω παρεμπόδισης της ενεργοποίησης της p53 από την Hsp70, αναστέλλοντας, επομένως, τον επακόλουθο αποπτωτικό μηχανισμό.Σε κυτταρικό επίπεδο, μελετήθηκαν, επίσης, η τοξικότητα της δοξορουβικίνης και ο προστατευτικός ρόλος της Hsp70 ενάντια στο φάρμακο. Σε πρωτογενείς κυτταρικές καλλιέργειες (F1/F1 και Tg/Tg), που απομονώθηκαν από τα ίδια πειραματόζωα και εκτέθηκαν σε διάφορες συγκεντρώσεις και χρόνους επώασης με δοξορουβικίνη, αποδείχθηκε η δοσο- και χρόνο-εξαρτώμενη τοξική επίδραση του φαρμάκου στα κύτταρα σε όλες τις πειραματικές διαδικασίες, που διενεργήθηκαν. Η βιοχημική μελέτη του επαγόμενου από δοξορουβικίνη αποπτωτικού μονοπατιού στις πρωτογενείς εμβρυϊκές κυτταρικές σειρές, αποκάλυψε ότι ενεργοποιείται η p53, η οποία, στη συνέχεια, προωθεί το μιτοχονδριακό αποπτωτικό μονοπάτι και τον καταρράκτη των κασπασών. Πιο συγκεκριμένα, η p53 φαίνεται να ενεργοποιεί τις Bax, κασπάση-9 και κασπάση-3, ενώ η ενεργοποίηση της PARP-1 αποκαλύπτει την επαγόμενη από DOX βλάβη του DNA. Το αποπτωτικό αυτό μονοπάτι φαίνεται να αναστέλλεται από την αυξημένη έκφραση της Hsp70 στα Tg/Tg κύτταρα. Συνεπώς, συμπεραίνεται ότι η Hsp70 μπορεί να αποτρέπει την προώθηση της απόπτωσης, που προκαλείται από τη δοξορουβικίνη, δρώντας σε ένα σημείο ανοδικά της ενεργοποίησης της p53. Η προστατευτική επίδραση της πρωτεΐνης Hsp70 αποδείχθηκε και με την εκτίμηση της δραστηριότητας των αντιοξειδωτικών ενζύμων, SOD και GPx. Η δοξορουβικίνη προκάλεσε δοσο- και χρόνο-εξαρτώμενη μείωση στα επίπεδα της δραστηριότητας των ενζύμων αυτών στα πρωτογενή εμβρυικά κύτταρα. Η δραστηριότητα των αντιοξειδωτικών ενζύμων ήταν εμφανώς αυξημένη στα Tg/Tg σε σύγκριση με τα F1/F1 κύτταρα, προτείνοντας ότι η παρουσία της Hsp70 προσδίδει στα κύτταρα μεγαλύτερη ανθεκτικότητα ενάντια στo προκαλούμενο από δοξορουβικίνη οξειδωτικό στρες.Τέλος, σε κλινικό επίπεδο, προσδιορίστηκαν ποσοτικά τα επίπεδα έκφρασης της επαγόμενης Hsp70 σε ορούς ασθενών με καρδιακή ανεπάρκεια. Από τα αποτελέσματα μας προέκυψε ότι στην καρδιακή ανεπάρκεια φαίνεται να αυξάνεται η συγκέντρωση της Hsp70 στους ορούς αίματος των ασθενών σε σχέση με αυτή των υγιών ατόμων. Η αυξημένη έκφραση της Hsp70 στους ορούς ασθενών με καρδιακή ανεπάρκεια φαίνεται να συσχετίζεται με διάφορες παραμέτρους, όπως το φύλο, την ηλικία και τον τύπο της καρδιακής ανεπάρκειας, αλλά όχι και με την αιτία πρόκλησης της ασθένειας.Συμπερασματικά, στην παρούσα εργασία μελετήθηκε η πιθανή σύνδεση της πρωτεΐνης Hsp70 με την καρδιακή ανεπάρκεια, ενώ ταυτόχρονα ήλθαν στο φως νέα στοιχεία σχετικά με τον πιθανό μηχανισμό δράσης της.