Μελέτη Των Μηχανισμών Μοριακής Σηματοδότησης Και Των Αθηροπροστατευτικών Δράσεων Της HDL Στα Ενδοθηλιακά Κύτταρα

Abstract

Πολυάριθμες επιδημιολογικές μελέτες έχουν δείξει ότι τα χαμηλά επίπεδα της λιποπρωτεΐνης υψηλής πυκνότητας (High Density Lipoprotein – HDL) στον ορό αποτελούν ισχυρό δείκτη κινδύνου για την ανάπτυξη Καρδιαγγειακών Νοσημάτων (ΚΝ). Παράλληλα, έχουν ανακαλυφθεί αρκετές προστατευτικές ιδιότητες της HDL απέναντι στην ανάπτυξη της αθηροσκλήρωσης, η οποία είναι η παθολογική αιτία των ΚΝ. Ωστόσο, σε ασθενείς με ΚΝ, η χρήση φαρμάκων που στόχευαν στην αύξηση της συγκέντρωσης της HDL στον ορό δεν οδήγησε σε μείωση του κινδύνου εμφάνισης καρδιαγγειακών γεγονότων. Επιπρόσθετα, πρόσφατες έρευνες ανέδειξαν ότι οι ασθενείς με KN φέρουν ‘μη λειτουργική/δυσλειτουργική’ HDL, η οποία αδυνατεί να πραγματοποιήσει τις φυσιολογικές προστατευτικές της δράσεις. Από αυτά τα δεδομένα προκύπτει πώς από μόνη της η αύξηση των επιπέδων της HDL δεν αρκεί για να παρέχει αθηροπροστασία αλλά πρέπει να συνοδεύεται και από την ύπαρξη λειτουργικής HDL. Παράλληλα, κάποια φάρμακα που στοχεύουν στην αύξηση των επιπέδων της HDL προκάλεσαν σημαντικές παρενέργειες στους ασθενείς αναδεικνύοντας την πολυπλοκότητα των μεταβολικών μονοπατιών αλλά και την ελλιπή, μέχρι σήμερα, κατανόησή τους. Οι ερευνητικοί στόχοι της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν οι εξής: •Κεφάλαιο 1: Nα διευκρινιστούν οι μοριακοί μηχανισμοί μέσω τον οποίων η HDL επιφέρει την αθηρο-προστατευτική της δράση στα ενδοθηλιακά κύτταρα. Για αυτό τον στόχο, στις Ενότητες I και II επικεντρωθήκαμε στην ανίχνευση γονιδίων-στόχων της HDL στα ενδοθηλιακά κύτταρα αλλά και στη μελέτη των μηχανισμών μέσω των οποίων πραγματοποιούνται οι συγκεκριμένες ρυθμίσεις, ενώ στην Ενότητα III, μελετήσαμε την λειτουργικότητα της HDL που έχει απομονωθεί από ασθενείς με μια χρόνια φλεγμονώδη νόσο (την αγκυλοποιητική σπονδυλίτιδα).•Κεφάλαιο 2: Να διερευνηθούν σε μοριακό επίπεδο νέα γονίδια και miRNAs που ρυθμίζουν την βιογένεση της HDL στα ηπατικά κύτταρα. Για τον σκοπό αυτόν, στην Ενότητα IV μελετήσαμε την ρύθμιση του γονιδίου του μεταγραφικού παράγοντα LXRα από τον ηπατικό μεταγραφικό παράγοντα HNF-4α, ενώ στην Ενότητα V μελετήσαμε τον ρόλο του miRNA let-7b στην ρύθμιση της απολιποπρωτεΐνης Ε (apoE) στα ηπατικά κύτταρα HepG2.Ο τραυματισμός ή ‘δυσλειτουργική’ δράση του ενδοθηλίου έχει συσχετιστεί με την έναρξη και ανάπτυξη της αθηρωματικής πλάκας. Η HDL αποτελεί ρυθμιστή της φυσιολογικής λειτουργίας του ενδοθηλίου και ενεργοποιεί μηχανισμούς προστασίας του μετά από τραύμα, ενώ η ‘δυσλειτουργική’ HDL δεν έχει αυτές τις δράσεις. Για αυτό τον λόγο, στον Κεφάλαιο 1 θέλαμε να ανιχνεύσουμε τους μοριακούς μηχανισμούς δράσης της φυσιολογικής HDL στο ενδοθήλιο. Τα γονίδια στα οποία επικεντρωθήκαμε στις δύο πρώτες ενότητες, αντλήθηκαν από microarray δεδομένα, τα οποία είχαν παραχθεί σε προηγούμενες μελέτες της ερευνητική μας ομάδας ύστερα από επίδραση ενδοθηλιακών κυττάρων με ανασυσταθείσα HDL που φέρει την ανθρώπινη απολιποπρωτεΐνη Α-Ι (rHDL-AI). Εμείς μελετήσαμε την ανταπόκριση αυτών των γονιδίων ύστερα από επίδραση με φυσική HDL που απομονώθηκε από διαγονιδιακούς ποντικούς που εξέφραζαν την ανθρώπινη απολιποπρωτεΐνη-Α-Ι (tgHDL).Πιο συγκεκριμένα, στην ενότητα I επικεντρωθήκαμε στη ρύθμιση του γονιδίου της Angiopoietin-like 4 (ANGPTL4), το οποίο έχει σημαντικό ρόλο στον μεταβολισμό των λιπιδίων και στην αθηρωμάτωση. Παρατηρήσαμε ότι τόσο η φυσική HDL (tgHDL) όσο και η ανασυσταθείσα HDL (rHDL-AI) ενεργοποιούν την έκφραση της ANGPTL4. Για την ανίχνευση των μηχανισμών μέσω του οποίου η tgHDL ενεργοποιεί το συγκεκριμένο γονίδιο χρησιμοποιήσαμε γνωστούς αναστολείς κινασών και παρατηρήσαμε ότι η δράση της tgHDL γίνεται μέσω των μονοπατιών της AKT και της p38-MAPK. Επιπρόσθετα, με πειράματα διαχωρισμού πυρηνικών από κυτταροπλασματικές πρωτεΐνες και ανοσοϊστοχημείας, παρατηρήσαμε ότι η tgHDL έχει την ικανότητα, μέσω του μονοπατιού της AKT, να επάγει την φωσφορυλίωση του πυρηνικού μεταγραφικού παράγοντα Forkhead Box O1 (FOXO1) με αποτέλεσμα την μετατόπισή του στο κυτταρόπλασμα και την απενεργοποίηση της μεταγραφικής του δράσης. Συνδυάζοντας διαφορετικές πειραματικές προσεγγίσεις για την απενεργοποίηση του FOXO1 στα ενδοθηλιακά κύτταρα με παράλληλη επίδραση ή όχι της tgHDL, είδαμε ότι o FOXO1 έχει ανασταλτικό ρόλο στην ενεργοποίηση του γονιδίου της ANGPTL4, όπου η απενεργοποίηση του από την HDL οδηγεί σε καταστολή της έκφρασης της ANGPTL4. Στην ενότητα II επικεντρωθήκαμε στην ρύθμιση του γονιδίου της ενδοθηλιακής λιπάσης (LIPG), η οποία εμπλέκεται στον καταβολισμό της HDL. Αρχικά παρατηρήσαμε ότι η φυσική HDL (tgHDL) μείωνε την έκφραση της LIPG σε αντίθεση με την rHDL-ΑΙ που την αύξανε. Επικεντρωθήκαμε στην δράση της tgHDL και διαπιστώσαμε ότι όχι απλά μείωνε την έκφραση της LIPG αλλά εμπόδιζε την ενεργοποίηση του γονιδίου σε συνθήκες έλλειψης θρεπτικού ορού (starvation). Πειράματα αποσιώπησης της έκφρασης του FΟΧΟ1 με siRNAs οδήγησαν σε μείωση των επιπέδων της LIPG, αναδεικνύοντας ότι ο FOXO1 είναι σημαντικός για την ενεργοποίηση του συγκεκριμένου γονιδίου από το starvation αλλά και ότι η HDL μειώνει την έκφραση της LIPG μέσω της απενεργοποίησης του FOXO1. Επιπρόσθετα της δράσης του FOXO1, παρατηρήσαμε ότι η HDL εμποδίζει την έκφραση ενός επιπλέον γονιδίου ώστε να αναστείλει την ενεργοποίηση της LIPG από το starvation. Στην ενότητα III διερευνήσαμε την λειτουργικότητα της HDL που έχει απομονωθεί από ασθενείς με αγκυλοποιητική σπονδυλίτιδα (ΑΣ), μια χρόνια φλεγμονώδη νόσο. Παρατηρήσαμε ότι η HDL που είχε απομονωθεί από υγιή άτομα είχε την ικανότητα να φωσφορυλιώνει την κινάση ΑΚΤ ενώ αντίθετα, η HDL που απομονώθηκε από ασθενείς με ΑΣ οδήγησε σε μειωμένη φωσφορυλίωση της AKT στα ενδοθηλιακά κύτταρα υποδεικνύοντας την παρουσία μη-λειτουργικής HDL στους ασθενείς αυτούς.Παρότι η HDL συγκροτείται εξωκυττάρια, το ήπαρ αποτελεί την κύρια πηγή παραγωγής των πρωτεϊνών που εμπλέκονται στη βιογένεση της HDL. Για αυτό τον λόγο, στο Κεφάλαιο 2 χρησιμοποιήσαμε κύτταρα ανθρώπινου ηπατοβλαστώματος HepG2 ώστε να μελετήσουμε τους μηχανισμούς ρύθμισης της έκφρασης γονιδίων που συμμετέχουν στον μεταβολισμό της HDL.Στην ενότητα IV μελετήσαμε τον μηχανισμό με τον οποίο ρυθμίζεται στο ήπαρ το γονίδιο του μεταγραφικού παράγοντα LXRα. Ο LXRα (Liver X Receptor α) διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στο μεταβολισμό των λιπιδίων και της χοληστερόλης, διότι ελέγχει άμεσα την έκφραση των γονιδίων που εμπλέκονται σε αυτά τα μονοπάτια (για παράδειγμα των ABCA1, ABCG1, SREBP κλπ). Παρατηρήσαμε ότι ο υποκινητής του γονιδίου του LXRα του ανθρώπου (hLXRα) ενεργοποιείται από την δράση του HNF-4α, ο οποίος είναι ένας μεταγραφικός παράγοντας που εκφράζεται κυρίως στο ήπαρ και αποτελεί γενικό ρυθμιστή των γονίδιων που ενεργοποιούνται στο ήπαρ. Με πειράματα ChiP και DNAP εντοπίσαμε το σημείο πρόσδεσης του HNF-4α στον υποκινητή του LXRα στην περιοχή -50 με -40. Μετάλλαξη στο συγκεκριμένο μοτίβο πρόσδεσης οδήγησε σε απώλεια της ικανότητας του HNF-4α να ρυθμίζει θετικά την ενεργότητα του υποκινητή του LXRα. Αποσιώπηση του γονιδίου του HNF-4α οδήγησε σε μείωση των επιπέδων της πρωτεΐνης LXRα. Στην ενότητα V μελετήσαμε την ικανότητα του micro-RNA let-7b να ρυθμίζει την έκφραση του γονιδίου της απολιποπρωτεΐνης Ε (apoE) σε HepG2 κύτταρα. Η αποΕ παίζει σημαντικό ρόλο στην απομάκρυνση των υπολειμμάτων των λιποπρωτεϊνών από την κυκλοφορία αλλά και στην βιογένεση της HDL. Υπερέκφραση του let-7b προκάλεσε μείωση των επιπέδων τόσο του mRNA όσο και της πρωτεΐνης της apoE. Ωστόσο, η υπερέκφραση του let-7b δεν επηρέασε την ενεργότητα ενός πλασμιδίου που είχε κλωνοποιημένη την 3’-UTR περιοχή του mRNA της αποΕ υποδηλώνοντας ότι το let-7b δεν ρυθμίζει άμεσα, μέσω της 3’-UTR περιοχής, την έκφραση της apoE. Επιπρόσθετα, σε πειράματα όπου συνεκφράσαμε τον υποκινητή της apoE (-500/+73) με το let-7b είδαμε την ενεργότητα του υποκινητή να μειώνεται επιβεβαιώνοντας τον έμμεσο τρόπο ρύθμισης αυτού του γονιδίου από το let-7b. Παράλληλα, διαπιστώσαμε την ικανότητα του let-7b να ρυθμίζει την έκφραση και της αποΑ-Ι, η οποία είναι η κύρια πρωτεΐνη της HDL. Παρατηρήσαμε ότι υπερέκφραση του let-7b μείωσε τόσο το mRNA της αποΑ-Ι όσο και την ενεργότητα του υποκινητή (-1020/-24) της. Βιοπληροφορική ανάλυση στο mRNA της αποΑ-Ι δεν ανέδειξε κάποιο σημείο πρόσδεσης του let-7b προτείνοντας ότι η αποΑ-Ι, όπως και η αποΕ, ρυθμίζονται με διαφορετικό από τον κλασσικό τρόπο από το let-7b. Συμπερασματικά, τα ευρήματα της παρούσας διατριβής προσφέρουν νέα γνώση πάνω στους μηχανισμούς που ελέγχουν τα επίπεδα και την λειτουργικότητα της HDL. Τα γονίδια που βρέθηκαν στην παρούσα μελέτη να μεσολαβούν στις δράσεις της HDL στα ενδοθηλιακά και στα ηπατικά κύτταρα θα μπορούσαν να έχουν διαγνωστική και θεραπευτική αξία σε ασθενείς με χαμηλά επίπεδα HDL ή με μη-λειτουργική HDL όπως ασθενείς με Καρδιαγγειακά Νοσήματα ή χρόνια φλεγμονώδη νοσήματα.