Μελέτη Του Ρόλου Των Συνδεκανών Στην Παθογένεια Του Ινοσαρκώματος Και Διερεύνηση Της Επίδρασης Των Αυξητικών Παραγόντων

Abstract

Η παρούσα διδακτορική διατριβή επικεντρώθηκε στη μελέτη των μηχανισμών λειτουργίας του ανθρώπινου ινοσαρκώματος. Πρόκειται για έναν σπάνιο όγκο βάσει της τελευταίας ιστολογικής ταξινόμησης, ο οποίος όμως, εμφανίζει πτωχή πρόγνωση. Το συγκεκριμένο σάρκωμα μαλακών μορίων προέρχεται από την κακοήθη εξαλλαγή των ινοβλαστών, κυττάρων που διαμορφώνουν τον εξωκυττάριο χώρο (ΕCM) και στηρίζουν τους ιστούς. Τα κύτταρα του ινοσαρκώματος είναι χαρακτηριστικά ατρακτοειδή, με επέκταση του προσθίου άκρου τους και μεγάλη κινητικότητα. Είναι γνωστό ότι τα κύτταρα του ινοσαρκώματος έχουν ρόλο στη ρύθμιση της λειτουργίας του ECM. Πρόκειται για ένα περίπλοκο δίκτυο πρωτεογλυκανών, ινωδών πρωτεϊνών και υαλουρονικού οξέος, που υποστηρίζει και προστατεύει τα κύτταρα εντός των ιστών. Επιπλέον, ο ECM δημιουργεί και μεταφέρει πολλαπλά σύνθετα ερεθίσματα σε κύτταρα, επηρεάζοντας τη συμπεριφορά τους και τις βασικές τους λειτουργίες. Πράγματι, ο ECM είναι μια δεξαμενή αυξητικών παραγόντων,όπως ο αυξητικός παράγοντας του μετασχηματισμού (TGF), ο επιδερμικός αυξητικός παράγοντας (EGF), ο αυξητικός παράγοντας των ινοβλαστών 2 (FGF2), ο αγγειακός ενδοθηλιακός αυξητικός παράγοντας (VEGF), ο ινσουλινόμορφος αυξητικός παράγοντας (IGF), αλλά και ενζύμων όπως οι μεταλλοπρωτεϊνάσες της εξωκυττάριας ουσίας (MMPs), οι συνθάσες, οι τρανσφεράσες και οι σουλφάσες, καθώς και άλλων μακρομορίων που ρυθμίζουν τη κυτταρική συμπεριφορά. Οι πρωτεογλυκάνες είναι μόρια που αποτελούνται από γλυκοζαμινογλυκανικές αλυσίδες (GAG), ομοιοπολικά συνδεδεμένες σε ένα πρωτεϊνικό κορμό και ταξινομούνται με βάση τις αλυσίδες τους σε πρωτεογλυκάνες θειϊκής κερατάνης (KSPGs), θειϊκής ηπαράνης (HSPGs), θειϊκής χονδροϊτίνης(CSPGs) και θειϊκής δερματάνης (DSPGs). Έχουν την ικανότητα να επηρεάζουν τις κυτταρικές λειτουργίες και εν τέλει την πρόοδο ενός όγκου με διάφορους τρόπους.Την πολυδύναμη λειτουργικότητά τους την οφείλουν στη μοναδική τους μορφολογία, αλλά και τις μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις που υφίστανται από ένζυμα. Το αποτέλεσμα είναι διαφορετική εντόπιση, αποδόμηση, ανακύκλωση,αλληλεπίδραση με άλλα μακρομόρια (όπως αυξητικούς παράγοντες) και διαφορετική σηματοδότηση επί τα εντός και επί τα εκτός του κυττάρου. Οι πρωτεογλυκάνες έχουν ως ιδιαίτερο χαρακτηριστικό την άμεση επαφή με τον εξωκυττάριο χώρο και κατά συνέπεια τη μεταβίβαση των περιβαλλοντικών αλλαγών προς τα ενδότερα του κυττάρου, μεταφρασμένων πλέον ως ενδοκυττάρια σήματα.Η συνδεκάνη 2 (SDC2), μία πρωτεογλυκάνη θειϊκής ηπαράνης, είναι πολύ σημαντική για τον πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση των κυττάρων του ανθρώπινου ινοσαρκώματος (ΗΤ1080). Ένα μονοπάτι που επάγεται από τη SDC2,είναι το FAK (focal adhesion kinase)/PI3K (Phosphoinositide 3-kinase)/Rac (RasrelatedC3 botulinum toxin substrate 1), μέσω του οποίου αλλάζει τον κυτταροσκελετό της ακτίνης και κατά συνέπεια αυξάνει τη μετανάστευση των κυττάρων του ινοσαρκώματος ΗΤ1080. Ένας από του αυξητικούς παράγοντες που διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην εξέλιξη του ινοσαρκώματος είναι ο TGFβ2. Έχει καταγραφεί ότι ρυθμίζει την παραγωγή μορίων στον εξωκυττάριο χώρο, καθώς και τη διεισδυτικότητα και τη μετανάστευση των κυττάρων του ανθρώπινου ινοσαρκώματος. Στην παρούσα μελέτη παρουσιάζουμε την ικανότητα του TGFβ2 να ενισχύει την προσκόλληση των κυττάρων ΗΤ1080 στην ινονεκτίνη (FN) (p ≤ 0.01), μία λειτουργία που σχετίζεται με την ικανότητα διείσδυσης ενός όγκου. Η επίδραση τουTGFβ2 στην ικανότητα προσκόλλησης των κυττάρων επηρεάζεται από την παρουσία της SDC2, καθώς τα ελλιπή σε SDC2 κύτταρα εμφανίζουν έντονη αναστολή τηςTGFβ2-εξαρτώμενης προσκόλλησης στην FN (p ≤ 0.01).Διαπιστώσαμε επίσης ότι η SDC2 ρυθμίζει την ενεργοποίηση του Smad2, ενός κύριου διαμεσολαβητή της δράσης του TGFβ2. Φάνηκε ότι η απουσία της SDC2,οδηγεί σε σημαντική καταστολή της επαγόμενης από τον TGFβ2 φωσφορυλίωσης του Smad2 (p ≤ 0.05).Είναι γνωστό ότι η SDC2 εντοπίζεται μαζί με έναν από τους υποδοχείς τουTGF, τον TGFRIII. Παράλληλα, έχει βρεθεί ότι ελέγχει τόσο την παραγωγή τουTGFRIII, όσο και των TGFRI και II. Στη δική μας μελέτη επιβεβαιώσαμε την αναγκαιότητα της ύπαρξης της SDC2 για την έκφραση του TGFRIII (p ≤ 0.01) και προτείνουμε ότι η συγκεκριμένη πρωτεογλυκάνη ελέγχει την παρουσίαση τουTGFRIII στην κυτταρική μεμβράνη.Δείξαμε επίσης, ότι η SDC2 ελέγχει την εξαρτώμενη από τον ΤGF έκφραση (p≤ 0.05) και ενεργοποίηση (p ≤ 0.01) της FAK και της ιντεγκρίνης β1 (p ≤ 0.01), δύο γονιδίων απαραίτητων για την κυτταρική προσκόλληση στην FN.Στη συνέχεια μελετήσαμε τη σημασία των γλυκοζαμινογλυκανικών αλυσίδων θειϊκής ηπαράνης στις κυτταρικές λειτουργίες του ανθρώπινου ινοσαρκώματος. Έχει αποδειχθεί παλαιότερα ότι οι HS αλυσίδες επηρεάζουν την επαγόμενη από τονTGFβ κυτταρική κινητικότητα. Χρησιμοποιήσαμε την ηπαριτινάση για την ειδική πέψη των HS αλυσίδων δημιουργώντας ειδικούς επιτόπους (HS stubs). Με την αποκοπή των αλυσίδων HS, η προκαλούμενη από τον TGFβ2 προσκόλληση των ΗΤ1080 αναιρέθηκε σε μεγάλο βαθμό (p ≤ 0.001), αναδεικνύοντας την καίρια συμβολή των HS αλυσίδων στη συγκεκριμένη κυτταρική λειτουργία.Παράλληλα, η αποδόμηση των HS εμπόδισε την ενεργοποίηση του Smad2 από τον TGFβ2 (p ≤ 0.001). Η καταστολή του σηματοδοτικού μονοπατιού του TGFβ2 θα μπορούσε να ερμηνεύσει την επίδραση των HS στην αναστολή της προσκόλλησης των ΗΤ1080 από τον TGFβ2. Τέλος, η παρούσα διατριβή διερευνά τον πιθανό ρόλο του IGF-I στην πρόοδο του ανθρώπινου ινοσαρκώματος. Πρόκειται για μία γνωστή αναβολική ορμόνη, με αποδεδειγμένες, ισχυρά ογκογόνες ιδιότητες. Για την πλειοψηφία των λειτουργιών που επιτελεί, σηματοδοτεί μέσω δύο κύριων μονοπατιών: του PI3K(Phosphoinositide 3-kinase)/AKT (serine/threonine kinase) και του MAPK(mitogen-activated protein kinase)/ERK (extracellular signal-regulated kinases).Εξετάζοντας τη δράση του ΙGF-I στα κύτταρα ΗΤ1080, παρατηρήσαμε με ενδιαφέρον ότι ενισχύει σημαντικά τη μετανάστευση των κυττάρων (p ≤ 0.001).Είναι γνωστό ότι η SDC2 , η οποία βρίσκεται σε αφθονία στο ινοσάρκωμα, έχει την ικανότητα να ρυθμίζει την κινητικότητα των κυττάρων διαμορφώνοντας τον κυτταροσκελετό. Έχοντας υπόψιν τις μοναδικές της ιδιότητες, διερευνήσαμε τη συμμετοχή της στις δράσεις του ΙGF-I. To αποτέλεσμα της καταστολής του γονιδίου της SDC2 ήταν να παρεμποδιστεί τελικά η εξαρτώμενη από τον IGF-I μετανάστευση των κυττάρων ΗΤ1080 (p ≤ 0.001).Γνωρίζοντας ότι η SDC2 διαδραματίζει το ρόλο του συν-υποδοχέα για διάφορους αυξητικούς παράγοντες [FGF (αυξητικός παράγοντας των ινοβλαστών),GM-CSF (αυξητικός παράγοντας διέγερσης αποικιών των κοκκιοκυττάρων), κτλ],εξετάσαμε το ενδεχόμενο ο IGF-IR να ανήκει σ’αυτήν την κατηγορία. Στην παρούσα διατριβή δείχνουμε για πρώτη φορά τη συνύπαρξη της SDC2 μαζί με τον IGF-IR,αναδεικνύοντας έτσι τη SDC2 ως πιθανό συν-υποδοχέα για τον ΙGF-I.Στην προσπάθειά μας να μελετήσουμε σε μεγαλύτερο βάθος τον τρόπο με τον οποίο η SDC2 επηρεάζει τη σηματοδότηση και κατά συνέπεια την κυτταρική μετανάστευση μέσω του IGF-I, εξετάσαμε την επίδραση της SDC2 στην ενεργοποίηση του ERK1/2. Διαπιστώσαμε ότι η SDC2 είναι απαραίτητη για τη φωσφορυλίωση τουERK1/2 (p ≤ 0.001), καθώς και ότι αντίστοιχα ο ERK1/2 είναι αναγκαίος για την επαγόμενη από τον IGF-I μετανάστευση των ΗΤ1080 (p ≤ 0.001). Τα αποτελέσματα αυτά πιθανώς σημαίνουν ότι ένας τρόπος με τον οποίο η SDC2 επηρεάζει την εξαρτώμενη από τον IGF-I μετανάστευση των ΗΤ1080 είναι η ενεργοποίηση του ΕRΚ1/2, η οποία είναι γνωστό ότι ρυθμίζει τη μεταγραφή απαραίτητων γονιδίων για τη συμπεριφορά του κυττάρου.Τέλος, μελετήσαμε την ezrin, μια πρωτεΐνη που συνδέει μεμβρανικούς υποδοχείς με τον κυτταροσκελετό και έχει βρεθεί να εντοπίζεται συγκεκριμένα μαζί με τη SDC2 σε μικροπροσεκβολές κυττάρων ομοίων με τους ινοβλάστες. Αποτέλεσε ιδιαίτερα ενδιαφέρον εύρημα η αύξηση της ενεργοποίησης της ezrin (p ≤ 0.01) κατάχρονοεξαρτώμενο τρόπο, για πρώτη φορά στα κύτταρά μας, μετά την προσθήκη τουIGF-I. Παράλληλα, επιβεβαιώσαμε ότι η ezrin συνυπάρχει με τη SDC2, καθώς και με την ακτίνη στις έντονες μικροπροσεκβολές των κυττάρων ΗΤ1080, ρυθμίζοντας εν μέρει κατ’αυτόν τον τρόπο την κινητικότητα και την επιθετική συμπεριφορά των κυττάρων. Με τους παραπάνω μηχανισμούς, αναδεικνύεται σε σημαντικό βαθμό η δράση της SDC2 στην παθογένεια του ινοσαρκώματος και ιδιαίτερα η συμμετοχή της στη σηματοδότηση των αυξητικών παραγόντων TGFβ και IGF-I, που ρυθμίζουν την προσκόλληση και τη μετανάστευση αντίστοιχα, των κυττάρων του ανθρώπινου ινοσαρκώματος HT1080.