Μελέτη Του Ρόλου Των Ρετρομεταθετών Στοιχείων Στην Υπερδιέγερση Των Ωοθηκών Και Την Εμβρυογένεση

Abstract

Τα ρετρομεταθετά στοιχεία αποτελούν επαναλαμβανόμενες ακολουθίες DNA και απαντώνται σε πολλά αντίγραφα στο γένωμα όλων των οργανισμών. Λόγω της ικανότητάς του να μετακινούνται και να αυξάνουν τον αριθμό αντιγράφων τους, έχουν διαδραματίσει σημαντικό ρόλο στη δομή, τη λειτουργία και την εξέλιξη του γενώματος των ευκαρυωτικών οργανισμών. Ωστόσο, από το σύνολο των ρετρομεταθετών στοιχείων, λόγω συσσώρευσης μεταλλάξεων, μόνο ένας μικρός αριθμός από αυτά έχει παραμείνει ενεργός. Γεγονότα ρετρομετάθεσης έχουν παρατηρηθεί σε γαμετικά κύτταρα, σε καρκινικά κύτταρα, σε νευρικά κύτταρα εγκεφάλου και σε πρώιμα στάδια εμβρυϊκής ανάπτυξης. Τα κύτταρα ελέγχουν την έκφραση των ρετρομεταθετών στοιχείων μέσω μηχανισμών, όπως η μεθυλίωση του DNA και ο μεταμεταγραφικός έλεγχος που ασκούν τα μικρά, μη-κωδικά μόρια RNAi, για να εξασφαλίζουν τη δομική και τη λειτουργική ακεραιότητα του γενώματός τους. Σκοπός της ερευνητικής εργασίας αποτέλεσε η μελέτη της παρουσίας των γεγονότων ρετρομετάθεσης στο εσωτερικό ώριμων σπερματοζωαρίων και η μελέτη του ρόλου των ρετρομεταθετών στοιχείων στη φυσιολογική πορεία της προεμφυτευτικής ανάπτυξης εμβρύων μυός. Ταυτόχρονα, μελετήθηκε η επίδραση της αναστολής του ενζύμου της ανάστροφης μεταγραφάσης στη γαμετογένεση και στην in vitro πρώιμη εμβρυϊκή ανάπτυξη. Για τη μελέτη των γεγονότων ρετρομετάθεσης χρησιμοποιήθηκαν πλασμιδιακοί φορείς που φέρουν κλωνοποιημένα τα ανθρώπινα ρετρομεταθετά στοιχεία LINE-1, τα ανθρώπινα ρετρομεταθετά στοιχεία HERVK-10 και τα ρετρομεταθετά στοιχεία του μυός, VL30. Τα υπό μελέτη στοιχεία φέρουν ενσωματωμένη ειδική κασέτα ανίχνευσης των γεγονότων ρετρομετάθεσης, η οποία στηρίζεται στην έκφραση της EGFP. Οι εξωγενείς πλασμιδιακοί φορείς δεσμεύονται αυθόρμητα από τα σπερματοζωάρια και ενσωματώνονται στο εσωτερικό τους, και μέσω in vitro γονιμοποίησης, μεταφέρονται παθητικά από τα σπερματοζωάρια στα ωάρια. Για τη μελέτη της αναστολής του ενζύμου της ανάστροφης μεταγραφάσης, χρησιμοποιήθηκαν οι αναστολείς Lamivudine και Nevirapine, οι οποίοι χορηγήθηκαν σε αρσενικούς και θηλυκούς μύες, για διάστημα 10 εβδομάδων. Προστέθηκαν επίσης στο καλλιεργητικό μέσο ανάπτυξης των εμβρύων και μελετήθηκε ο ρόλος τους στην φυσιολογική προεμφυτευτική πορεία των εμβρύων μυός. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν πως α. τα σπερματοζωάρια ενσωματώνουν τα εξωγενή ρετρομεταθετά στοιχεία και ευνοούν την παρουσία γεγονότων ρετρομετάθεσης β. τα σπερματοζωάρια μεταφέρουν τα εξωγενή ρετρομεταθετά στοιχεία στα ωάρια μέσω της γονιμοποίησης γ. η υπερέκφραση των ρετρομεταθετών στοιχείων επηρεάζει τη φυσιολογική πορεία της πρώιμης ανάπτυξης εμβρύων μυός δ. η αναστολή του ενζύμου της ανάστροφης μεταγραφάσης επηρεάζει τη φυσιολογική πορεία της σπερματογένεσης και της ωογένεσης, καθώς και τη φυσιολογική προεμφυτευτική ανάπτυξη εμβρύων μυός.