Μελέτη της σχέσης δομή - λειτουργία του κύριου μεταφορέα προλίνης (PrnB) στο μύκητα Aspergillus nidulans

Abstract

Το γονίδιο prnB του μύκητα Aspergillus nidulans κωδικοποιεί ένα ειδικό για την προλίνη μεταφορέα. Ο μεταφορέας αυτός είναι μια διαμεμβρανική πρωτεΐνη με κυτταροπλασματικό αμινοτελικό και καρβοξυτελικό άκρο, που αποτελείται από 12 πιθανά διαμεμβρανικά τμήματα α-έλικας (TMS: Transmembrane segments), τα οποία συνδέονται μεταξύ τους με μικρές υδρόφιλες θηλειές (L: loops). Η πρωτεΐνη PrnB ανήκει στην οικογένεια μεταφορέων APC (Amino Acid Polyamine Organocation) μέλη της οποίας εντοπίζονται σε προκαρυωτικούς και ευκαρυωτικούς οργανισμούς. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή μελετήθηκαν οι σχέσεις δομής-λειτουργίας του μεταφορέα PrnB μέσω της γενετικής, μοριακής και βιοχημικής μελέτης στελεχών του Α. nidulans που εκφράζουν μεταλλαγμένες πρωτεΐνες PrnB. Οι εν λόγω μεταλλαγές είτε απομονώθηκαν γενετικά είτε κατασκευάσθηκαν με in vitro μεταλλαξιγένεση. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι παρερμηνεύσιμες μεταλλαγές που επηρεάζουν άμεσα ή έμμεσα τη λειτουργία της πρωτεΐνης PrnB εντοπίζονται στα L2-TMS3 (prnB6, prnB144), TMS6 (prnBKL, prnBKE, prnB119), L6-TMS7 (prnB81), L8-TMS9-L9 (prnB117, prnB206, prnB508) και L10-TMS11 (prnB411) τμήματά της. Από τις παραπάνω μεταλλαγές ιδιαίτερο ρόλο στη λειτουργία της πρωτεΐνης PrnB φαίνεται να διαδραματίζουν τα αμινοξέα Κ245 και F248 του TMS6. Η Κ245 είναι ένα από τα δύο θετικά φορτισμένα αμινοξέα που εντοπίζονται μέσα σε διαμεμβρανικά τμήματα της PrnB ενώ η F248 είναι αυστηρά συντηρημένη σε όλα τα μέλη της οικογένειας APC που είναι καταχωρημένα στην τράπεζα δεδομένων SWISS-PROT. Αλλαγή των αμινοξέων αυτών προκαλεί σημαντική μείωση της χημικής συγγένειας της PrnB για την προλίνη. Επιπλέον, σημαντικό ρόλο στη λειτουργία της PrnB φαίνεται να έχει η περιοχή L8-TMS9, η οποία αντιστοιχεί στη σημαντική για τη λειτουργία μεταφορέων αμινοξέων συναινετική αμφιπαθική περιοχή CAR (Consensus Amphipathic Region). Διπλασιασμός 2 και 3 αμινοξέων στην εν λόγω περιοχή προκαλεί πλήρη απώλεια λειτουργίας και σημαντική μεταβολή των τιμών Km και Vmax της PrnB, αντίστοιχα. Ενδιαφέρον αποτελεί το γεγονός ότι αντίστοιχα με τα παραπάνω τμήματα άλλων μελών της οικογένειας μεταφορέων APC έχει δειχθεί ότι είναι σημαντικά για τη λειτουργία των μεταφορέων αυτών. Εν κατακλείδι, τα παραπάνω αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι οι περιοχές TMS6 και L8-TMS9 του μεταφορέα PrnB αποτελούν μέρος της οδού πρόσδεσης ή/και μεταφοράς της προλίνης διαμέσω της κυτταρικής μεμβράνης. Στα πλαίσια εμβάθυνσης των σχέσεων δομής - λειτουργίας του μεταφορέα PrnB καθώς και για τη μελέτη της in vivo τοπογένεσής του χρησιμοποιήθηκε η πρωτεΐνη GFP (Green Fluorescent Protein). Ένας αριθμός χιμαιρικών γονιδίων prnB - gfp κατασκευάσθηκαν, ενσωματώθηκαν στο γενετικό τόπο του γονιδίου prnB, εκφράστηκαν από το φυσιολογικό παρακινητή του, και τα αντίστοιχα χιμαιρικά μόρια PrnB - GFP εντοπίστηκαν in vivo. Τα χιμαιρικά αυτά μόρια φέρουν 2, 4 ή 8 συνδετικά αμινοξέα μεταξύ των πρωτεϊνών PrnB και GFP. Τα εν λόγω αμινοξέα δεν τροποποιούν τη δευτεροταγή δομή των χιμαιρικών μορίων, καθώς επιλέχθηκαν να μην είναι συμβατά με το σχηματισμό στοιχείων δευτεροταγούς δομής. Βρέθηκε ότι μόνο τα χιμαιρικά μόρια με 4 συνδετικά αμινοξέα είναι πλήρως λειτουργικά στους 25°C (φυσιολογική θερμοκρασία ανάπτυξης του μύκητα). Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι ο αριθμός και το είδος των συνδετικών αμινοξέων μεταξύ των δύο μελών των χιμαιρικών μορίων είναι σημαντικός για τη "φυσιολογική" τοπογένεσή τους στην κυτταρική μεμβράνη. Επιπλέον, η χρήση της πρωτεΐνης GFP για τον in vivo εντοπισμό του διαμεμβρανικού μεταφορέα PrnB είναι δυνατή χωρίς να απαιτείται η υπερέκφραση του τελευταίου. Τέλος, η μέθοδος που αναπτύχθηκε για την κατασκευή χιμαιρικών PrnB-GFP μορίων δίνει τη δυνατότητα ενσωμάτωσης και έκφρασης οποιουδήποτε prnB- αλληλομόρφου. Αυτό έχει ως συνέπεια το διαχωρισμό των μεταλλαγών που επηρεάζουν άμεσα τη λειτουργία της πρωτεΐνης PrnB από αυτές που επηρεάζουν την τοπογένεσή της.