Μελέτη Και Αξιολόγηση Μικροφυκών Ως Πηγή Προϊόντων Υψηλής Προστιθέμενης Αξίας

Abstract

Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η μελέτη των ακατέργαστων υδατικών εκχυλισμάτων από μικροφύκη Chlorella sp., Nannochloropsis sp., Tetraselmis sp. και Phaeodactylum sp.. Μια τέτοια μελέτη στοχεύει στην ανάγκη εύρεσης νέων πράσινων πηγών, πλούσιων σε αντιοξειδωτικές ουσίες, ώστε να χρησιμοποιηθούν ως πρώτες ύλες στη βιομηχανία τροφίμων και καλλυντικών. Επιπρόσθετα, μελετήθηκαν ένζυμα GSTs από το γένος Chlamydomonas με στόχο την απόκτηση περαιτέρω γνώσεων που σχετίζονται με GSTs από θαλάσσιους οργανισμούς.Με στόχο την κατανόηση του ρόλου των GSTs στους φωτοσυνθετικούς οργανισμούς αλλά και την εύρεση στοιχείων για την ανάπτυξη νέων βιοτεχνολογικών εφαρμογών, ακολούθησε η μελέτη του γονιδιώματος Chlamidomonas reinhardtii. Τα αποτελέσματα φανέρωσαν την παρουσία 15 GST-like ενζύμων (CrGSTs) τα οποία αναλύθηκαν φυλογενετικά. Τα ισοένζυμα CrGST10 και CrGST7, που φαίνεται να ανήκουν στη Sigma τάξη, κλωνοποιήθηκαν, εκφράστηκαν σε βακτηριακά κύτταρα E. coli και προσδιορίστηκε η εκλεκτικότητά τους έναντι ηλεκτρονιόφιλων υποστρωμάτων. Ακολούθησε μελέτη της δομής και της κινητικής συμπεριφοράς με μοριακή μοντελοποίηση και κατευθυνόμενη μεταλλαξογέννεση. Συγκεκριμένα, επιβεβαιώθηκε ο καταλυτικός ρόλος του αμινοξέος Tyr7 ενώ διερευνήθηκε ο ρόλος του αμινοξέος Trp99 στον προσδιορισμό εξειδίκευσης ηηλεκτρονιόφιλων υποστρωμάτων, στην επίδραση του pH και στη θερμοσταθερότητα.Η διατριβή ολοκληρώθηκε με την απομόνωση του ενζύμου CrGST8 από cDNA βιβλιοθήκηChlamidomonas, το οποίο φαίνεται να ανήκει στην τάξη Theta. Η υπερέκφραση του ενζύμου CrGST8 οδήγησε σε ενδοκυτταρική συσσώρευση μερικώς αναδιπλωμένων πρωτεϊνών (έγκλειστα σωμάτια). Ακολούθησαν δοκιμές βελτιστοποίησης των συνθηκών έκφρασης με χρήση διαφορετικής συγκέντρωσης IPTG και θερμοκρασίας. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι συγκεκριμένοι παράγοντες δεν επηρεάζουν στη δημιουργία των συσσωματωμάτων. Στη συνέχεια έγινε χρήση χαοτροπικών ουσιών όπως η ουρία και το χλωρίδιο του γουανιδίου. Με σκοπό τον έλεγχο της επίδρασης μιας ηπιότερης μεθόδου αναδίπλωσης, έγινε δοκιμή διαλυτοποίησης του ενζύμου με χρήση προπανόλης. Θετικά αποτελέσματα παρουσίασαν μόνο οι χαοτροπικές ουσίες και κυρίως η ουρία. Έπειτα πραγματοποιήθηκε μελέτη της εκλεκτικότητας του ενζύμου έναντι διαφορετικών υποστρωμάτων. Η επίδραση του pH στην ενζυμική δραστικότητα του CrGST8 έδειξε ότι εμφανίζει προτίμηση στην όξινη περιοχή των pH με μέγιστη τιμή στο pH 5,6, ενώ σε pH 7 η ενζυμική δραστικότητα έχει σχεδόν μηδενιστεί.Συνοψίζοντας, τα μικροφύκη έχουν κεντρίσει την προσοχή του βιομηχανικού τομέα, με την εφαρμογή τους να απαντάται σε ποικιλία προϊόντων όπως σε τρόφιμα, φάρμακα και καλλυντικά. Η χρήση αντιοξειδωτικών από φυσικές και πράσινες πηγές όπως τα μικροφύκη αντιπροσωπεύει έναν τομέα που κερδίζει μεγάλο ενδιαφέρον στη διάρκεια του χρόνου με ευρύ φάσμα βιοτεχνολογικών εφαρμογών. Τα ευρήματά μας υπογραμμίζουν ότι τα εκχυλίσματα των ειδών Chlorella και κυρίως του στελέχους Chlorella minutissima, αντιπροσωπεύουν πολλά υποσχόμενα βιοδραστικά συστατικά με δυνατότητα χρήσης τους ως πρώτες ύλες. Tέλος, ο χαρακτηρισμός των ενζύμων CrGST10, CrGST7 και CrGST8 από το στέλεχος Chlamydomonas reinhardtii και η φυλογενετική ανάλυση έδωσαν πληροφορίες σχετικά με την εξέλιξη της οικογένειας των GSTs και το μηχανισμό δέσμευσης του υποστρώματος και εξειδίκευσης.