Μελέτη Επίδρασης Της Ηλεκτρομαγνητικής Ακτινοβολίας Σε Πρότυπα Βιολογικά Συστήματα

Abstract

Η ηλεκτρομαγνητική ακτινοβολία που έχει προκύψει από την ανάπτυξη της ασύρματης τεχνολογίας, εδώ και τρεις δεκαετίες, έχει αποτελέσει αντικείμενο εντατικής έρευνας ως προς τις πιθανές επιπτώσεις στην ανθρώπινη υγεία αλλά και σε άλλους ζωικούς ή φυτικούς οργανισμούς. Οι αντίστοιχες συσκευές (κινητά και ασύρματα τηλέφωνα, ασύρματα ρούτερ αλλά και γεννήτριες μικροκυμάτων), έχουν χρησιμοποιηθεί για πειραματικές και κλινικές προσεγγίσεις ενώ σημαντικός είναι και ο αριθμός επιδημιολογικών ερευνών.Στόχος της παρούσας Διατριβής ήταν η μελέτη της επίδρασης της μη-ιονίζουσας ηλεκτρομαγνητικής ακτινοβολίας (ΗΜΑ) από συσκευές ασύρματης τεχνολογίας τόσο σε καλλιέργειες ζωικών κυττάρων όσο και σε αναπτυσσόμενους ή ώριμους φυτικούς οργανισμούς. Η ακτινοβόληση υλοποιήθηκε με βάση συγκεκριμένα χρονοδιαγράμματα και πειραματικές διατάξεις. Ως πηγές μη-ιονίζουσας ΗΜΑ χρησιμοποιήθηκαν είτε μία συσκευή βάσης ασύρματου τηλεφώνου τύπου DECT είτε μία συσκευή κινητού τηλεφώνου GSM, σε κατάσταση ομιλούσας εκπομπής. Ο σχεδιασμός των πειραμάτων, η ακτινοβόληση και η δοσιμετρία έγιναν με μεγάλη ακρίβεια και ο πάσης φύσεως εξοπλισμός που χρησιμοποιήθηκε ελέγχθηκε σχολαστικά προκειμένου να καλύπτει τις προδιαγραφές που ισχύουν διεθνώς.Οι πειραματικές διαδικασίες και η βιοχημική προσέγγιση της επίδρασης της ΗΜΑ στις in vitro καλλιέργειες ζωικών κυττάρων, πραγματοποιήθηκαν στο Εργαστήριο Βιοχημείας (Ερευνητική Μονάδα Ι), του Τομέα Βιοχημείας και Μοριακής Βιολογίας καθώς και στον Τομέα Βιολογίας Κυττάρου και Βιοφυσικής του ΕΚΠΑ, ενώ οι πειραματικές καλλιέργειες στα φυτικά είδη που είχαν επιλεγεί καθώς και η περαιτέρω λεπτομερής ανατομική, υπερμικροσκοπική, ιστοχημική και βιοχημική μελέτη, προκειμένου να διερευνηθεί η επίδραση της μη-ιονίζουσας ΗΜΑ, έγιναν στο εργαστήριο Ανατομίας Φυτών του Τομέα Βοτανικής, στο Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών και στο Εργαστήριο Ηλεκτρονικής Μικροσκοπίας του Γεωπονικού Πανεπιστημίου Αθηνών.Στο πρώτο μέρος της διατριβής μελετήθηκε η επίδραση της μη-ιονίζουσας ΗΜΑ σε σειρές κυττάρων θηλαστικών με στόχο τη διερεύνηση της συνεπειών της στον μεταβολισμό πρωτεϊνικών μορίων που εμπλέκονται στην παθογένεση των νευροεκφυλιστικών νόσων, Alzheimer (AD) και Parkinson (PD). Οι συγκεκριμένες νόσοι χαρακτηρίζονται από προοδευτική απώλεια της δομής και λειτουργικότητας των νευρώνων και από εκτεταμένο νευρωνικό θάνατο. Οι ερευνητικοί στόχοι στο συγκεκριμένο σκέλος της ΔΔ, ήταν η μελέτη του μεταβολισμού της Προδρόμου Πρωτεΐνης του Αμυλοειδούς (ΑΡΡ) και της α-συνουκλεΐνης (AS). Οι μοριακοί παθογενετικοί μηχανισμοί που οδηγούν στην εκδήλωση της AD χαρακτηρίζονται από υπερπαραγωγή ή/ και συσσώρευση πεπτιδίων β-αμυλοειδούς (Αβ), μεταξύ νευρικών κυττάρων, γεγονός το οποίο οδηγεί στην δημιουργία νευριτικών πλακών στον εγκέφαλο των ασθενών. Το Αβ παράγεται ως αποτέλεσμα της πρωτεολυτικής επεξεργασίας της ΑΡΡ. Στην περίπτωση της PD δημιουργούνται, στον ενδοκυττάριο χώρο, τοξικά για τους νευρώνες συσσωματώματα της AS, τα οποία αποτελούν κύριο συστατικό των σωματίων Lewy, χαρακτηριστικά παθολογικά ευρήματα στους εγκεφάλους με PD. Η παθογένεση και εξέλιξη των νευροεκφυλιστικών ασθενειών σχετίζονται επίσης με δυσλειτουργία σε μεταβολικές, βιοχημικές και οξειδωτικές διαδικασίες στην περιφέρεια. Σύμφωνα με τα παραπάνω, η μελέτη εστιάστηκε στην επίδραση της μη-ιονίζουσας ΗΜΑ στον μεταβολισμό της ΑΡΡ και της AS, σε κυτταρικές σειρές νευρικής (SH-SY5Y) και μη νευρικής προέλευσης (ΗΕΚ293 και CHO). Υπογραμμίζεται ότι κατά την συνήθη ομιλία με κινητό τηλέφωνο, οι νευρώνες του εγκεφάλου βρίσκονται ιδιαίτερα κοντά στην εκπέμπουσα συσκευή. Για το λόγο αυτό επιλέχθηκε, για την έρευνά μας, η ανθρώπινη κυτταρική σειρά SH-SY5Y που αποτελεί πρότυπο των βιοχημικών και μοριακών μηχανισμών που διέπουν την παθογένεση του νευροεκφυλισμού.Ταυτόσημη πειραματική διάταξη και πρωτόκολλο ακτινοβόλησης, χρησιμοποιήθηκε σε όλες τις κυτταρικές σειρές. Δημιουργήθηκαν δύο καλλιέργειες ακτινοβόλησης μεταξύ των οποίων παρεμβλήθηκε συσκευή κινητού τηλεφώνου, ενώ παράλληλα, η πειραματική διάταξη συμπεριέλαβε, σε όλες τις περιπτώσεις, καλλιέργειες ελέγχου. Η ακτινοβόληση των κυττάρων έγινε 3 φορές για 10 λεπτά για δύο συνεχόμενες ημέρες. Μετά το τέλος της εκάστοτε περιόδου ακτινοβόλησης, οι καλλιέργειες κυττάρων παρέμεναν στον επωαστικό κλίβανο. Μετά το τέλος της δεύτερης ημέρας ακτινοβολήσεων, τα κύτταρα απομακρύνθηκαν από τα δοχεία καλλιέργειας και ακολούθησε η βιοχημική διερεύνηση για την επίδραση της ακτινοβολίας. Στα κύτταρα SH-SY5Y, η μη-ιονίζουσα ΗΜΑ είχε ως αποτέλεσμα την τροποποίηση της πρωτεολυτικής επεξεργασίας της ΑΡΡ, και την δημιουργία νέων αμυλοειδογενών πρωτεολυτικών θραυσμάτων στις ακτινοβολημένες καλλιέργειες. Μεγάλου ενδιαφέροντος θεωρείται το γεγονός ότι, η ακτινοβολία επέφερε τροποποίηση της κυτταρικής τοπολογίας των πρωτεολυτικών προϊόντων, γεγονός που πιθανά οδηγεί σε συνεπακόλουθη τροποποίηση των περαιτέρω αλληλεπιδράσεων των παραχθέντων αμυλοειδογενών πεπτιδίων. Η μελέτη των ακτινοβολημένων δειγμάτων αποκάλυψε εντυπωσιακή αύξηση της έκφρασης της μονομερούς AS. Τόσο η τροποποίηση της έκφρασης και πρωτεολυτικής επεξεργασίας της ΑΡΡ αλλά και η παρατηρούμενη σημαντική αύξηση της έκφρασης της AS, φαίνεται σύμφωνα με τα αποτελέσματά μας να σχετίζεται με την ένταση του πεδίου. Αξιοσημείωτο κρίνεται το γεγονός, ότι στα ακτινοβολημένα δείγματα παρουσιάστηκε σημαντική αύξηση των δραστικών μορφών οξυγόνου (ROS). Η παρατήρηση αυτή βρέθηκε να είναι σε συμφωνία με τα ποσοστά κυτταρικού θανάτου. Οι μελέτες συνεχίστηκαν με τη χρήση της μη-νευρικού τύπου κυτταρικής σειράς ΗΕΚ293. Τα συγκεκριμένα κύτταρα είναι επιθηλιακής μορφολογίας, μη καρκινικά εμβρυικά ανθρώπινα κύτταρα νεφρού τα οποία χρησιμοποιούνται ως πρότυπα σε βιολογικές και νευροφαρμακολογικές μελέτες. Τα αποτελέσματά μας επιβεβαίωσαν την τροποποίηση του προτύπου έκφρασης της ΑΡΡ και την επαγωγή δημιουργίας νέων αμυλοειδογενών θραυσμάτων. Ο θερμοεπαγόμενος διαχωρισμός φάσεων σύμφωνα με την υδροφοβικότητα, κατέδειξε την αλλαγή της κυτταρικής τοπολογίας των αμυλοειδογενών θραυσμάτων στα ακτινοβολημένα δείγματα. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει η τροποποίηση του προτύπου έκφρασης της AS σε σύγκριση με τα δείγματα του μάρτυρα, όπως και τροποποίηση του βαθμού ολιγομερισμού των μονομερών της AS. Η κυτταροτοξικότητα και η οξειδωτική καταπόνηση παρατηρήθηκαν και σε αυτή την κυτταρική σειρά. Η ερευνητική προσέγγιση επεκτάθηκε και στα κύτταρα CHO (κυτταρική σειρά από την ωοθήκη του κινεζικού χάμστερ). Τα CHO, χρησιμοποιούνται ως πρότυπα σε ερευνητικά πρωτόκολλα για τη μελέτη της έκφρασης και μεταβολισμού πρωτεϊνικών μορίων. Στην περίπτωση αυτή, δεν παρατηρήθηκε αξιοσημείωτη μεταβολή στο πρότυπο έκφρασης της πλήρους μήκους ΑΡΡ, μετά την ακτινοβόληση. Αξιοσημείωτο όμως, είναι το γεγονός ότι στα ακτινοβολημένα δείγματα, εμφανίστηκε εντυπωσιακή αύξηση αμυλοειδογενών και καρβοξυτελικών προϊόντων της ΑΡΡ, καθώς και τροποποίηση της κυτταρικής τοπολογίας των νεοπαραχθέντων θραυσμάτων και αύξηση των ενδογενών ελευθέρων ριζών. Τα αποτελέσματα στην μελέτη της επίδρασης της μη-ιονίζουσας ΗΜΑ στα συγκεκριμένα κύτταρα δεν έδειξαν κάποια σημαντική τροποποίηση στην έκφραση ή στον ολιγομερισμό της α-συνουκλεΐνης. Τέλος, μελετήθηκε η επίδραση της μη-ιονίζουσας ΗΜΑ στα κύτταρα CHO-7PA2. Τα κύτταρα αυτά, υπερεκφράζουν το πεπτίδιο Αβ, και χρησιμοποιούνται για την μελέτη μοριακών μηχανισμών που οδηγούν στην AD. Τα αποτελέσματά μας δεν κατέδειξαν αλλαγή στο πρότυπο της έκφρασης της ΑΡΡ και της AS. Παρατηρήθηκε όμως, αύξηση στην παραγωγή αμυλοειδογενών θραυσμάτων στα ακτινοβολημένα δείγματα. Συνολικά, τα αποτελέσματά μας δείχνουν για πρώτη φορά την επίδραση της μη-ιονίζουσας ΗΜΑ στον μεταβολισμό πρωτεϊνικών μορίων που εμπλέκονται στην παθογένεση των AD και PD. Στο δεύτερο μέρος της διατριβής τον λόγο είχαν τα φυτά. Αρχικά μελετήθηκε ένα πολύ γνωστό, ευρύτατα χρησιμοποιούμενο για πειράματα γενετικής και μοριακής βιολογίας φυτικό είδος, το Arabidopsis thaliana (Col.). Νεαρά φυτά τοποθετήθηκαν σε δύο ειδικά κατασκευασμένους κλωβούς Faraday, με πλήρη μόνωση από τις ακτινοβολίες, και καλλιεργήθηκαν σε ειδικό θάλαμο ελεγχόμενης θερμοκρασίας κάτω από επίσης ελεγχόμενες συνθήκες φωτισμού. Στον έναν από τους θαλάμους τοποθετήθηκε η βασική μονάδα ασύρματης τηλεφωνικής συσκευής DECT η οποία βρισκόταν σε συνεχή, εικοσιτετράωρη εκπομπή. Οι συνθήκες έκθεσης ήταν επακριβώς προσδιορισμένες και η όλη πειραματική διάταξη, με μικρές μόνο διαφορές στην χρονική διάρκεια των πειραμάτων, χρησιμοποιήθηκε και για την μελέτη των άλλων φυτικών ειδών που ακολούθησαν. Η πειραματική προσέγγιση για το Arabidopsis thaliana οδήγησε, αρχικά, στη διαπίστωση ότι τα εκτεθειμένα φυτά, αν συγκριθούν με τα φυτά – μάρτυρες, παρουσιάζουν σημαντική μείωση στη συνολική βιομάζα και διαφορές στη δομή του φύλλου τους. Τα φύλλα τους είναι λεπτότερα και τα κύτταρά τους φιλοξενούν λιγότερους χλωροπλάστες. Η ηλεκτρονική μικροσκοπία σάρωσης αποκάλυψε μικρές μόνο διαφορές στο τρίχωμα των επιδερμίδων (πολύ περισσότερες αποτρεπτικές τρίχες στα φυτά – μάρτυρες) ενώ η αντίστοιχη μικροσκοπία διέλευσης αποκάλυψε μικρής κλίμακας δομικές βλάβες στους χλωροπλάστες των ακτινοβολημένων φυτών. Η μείωση του αριθμού των χλωροπλαστών και η αποδιοργάνωση των θυλακοειδών στρώματος, στα κύτταρα των ακτινοβολημένων φυτών, είναι πιθανότατα και η βασική αιτία για την σημαντική μείωση των φωτοσυνθετικών χρωστικών που καταγράφηκε. Η αναπόφευκτη, συνεπώς, μείωση του φωτοσυνθετικού δυναμικού των ακτινοβολημένων φυτών οδηγεί και στην μείωση της παραγωγικότητας τους, κάτι που παρατηρήθηκε και στις τρεις επαναλήψεις των πειραμάτων.Ακολούθησε ένα ευρύτατα καλλιεργούμενο, και στην Ελλάδα, μεγάλης οικονομικής σημασίας φυτικό είδος, το Gossypium hirsutum L. (βαμβάκι). Χρησιμοποιήθηκε η ίδια πειραματική διάταξη και οι επαναλήψεις των πειραμάτων διήρκεσαν 3 εβδομάδες η καθεμία. Στη διάρκεια κάθε επανάληψης του πειράματος τα φυτά του ενός θαλάμου δέχονταν την μη-ιονίζουσα ΗΜΑ της μονάδας βάσης (1882 MHz) για είκοσι μία ημέρες, σε εικοσιτετράωρη βάση. Στο τέλος κάθε επανάληψης διαπιστώθηκε ότι τα εκτεθειμένα φυτά είχαν υποστεί σοβαρές βλάβες. Καταγράφηκε σημαντικά χαμηλότερη βιομάζα, τόσο στο υπέργειο όσο και στο υπόγειο τμήμα (ρίζα) των ακτινοβολημένων φυτών. Παρατηρήθηκε επίσης, μείωση των φωτοσυνθετικών χρωστικών τους και σοβαρές αλλοιώσεις στη δομή των χλωροπλαστών τους. Εντυπωσιακές είναι και οι αλλαγές στην λεπτή δομή των κυττάρων του φλοιού της ρίζας των ακτινοβολημένων φυτών. Συνολικά, οι διαφορές που παρουσιάζουν τα φυτά – μάρτυρες από τα εκτεθειμένα στην ακτινοβολία μπορούν να θεωρηθούν σημαντικές και να προκαλέσουν προβληματισμό, ειδικά αν διαφορές αυτές αναχθούν σε επίπεδο μεγάλης καλλιέργειας και παραγωγικότητας.Το επόμενο φυτό για πειραματική διερεύνηση ήταν το ευρύτερα καλλιεργούμενο φυτικό είδος στον πλανήτη, επίσης σημαντικό για την οικονομική σημασία του. Πρόκειται για το καλαμπόκι ή αραβόσιτο (Zea mays L.). Τα νερά φυτά του καλαμποκιού εκτέθηκαν, αξιοποιώντας την ίδια με τα παραπάνω πειραματική διάταξη, στη συνεχώς εκπεμπόμενη, μη-ιονίζουσα ΗΜΑ της συσκευής DECT. Τα ακτινοβολημένα φυτά, συγκρινόμενα με τα φυτά – μάρτυρες, δεν φαίνεται να επηρεάζονται όσον αφορά το φυτρωτικό δυναμικό τους, την παραγόμενη βιομάζα, τόσο στο υπέργειο όσο και στο υπόγειο (ρίζα) τμήμα τους, τη δομή τους φύλλου τους, τις φωτοσυνθετικές χρωστικές και την απορροφητική τους ικανότητα. Αυτό όμως που φαίνεται να επηρεάζεται και να παρουσιάζει σημαντικές βλάβες είναι το σύνολο των χλωροπλαστών που φιλοξενούνται στα κύτταρα του κολεού των δεσμίδων, στα φύλλα των ακτινοβολημένων φυτών. Αυτοί οι ιδιαίτερης δομής χλωροπλάστες εμφανίζουν είτε διόγκωση είτε πολλές πτυχώσεις των θυλακοειδών τους. Επειδή οι χλωροπλάστες αυτοί προσδίδουν ειδικό πλεονέκτημα στο συγκεκριμένο φυτό – όπως και σε όλα τα αγρωστώδη – όσον αφορά τη φωτοσύνθεση κάτω από δύσκολες περιβαλλοντικές συνθήκες, οι παραμορφώσεις που παρατηρούνται σε αυτούς, σε τόσο νεαρό στάδιο του κύκλου ζωής του φυτού, αποτελούν μη ευνοϊκή υποθήκη για το υπόλοιπο της ζωής του και, πιθανότατα, σοβαρό πρόβλημα σε επίπεδο καλλιέργειας και παραγωγής.Η χαλέπιος πεύκη (Pinus halepensis M.), ένα φυτό ευρύτατης διάδοσης στα φυσικά Μεσογειακά οικοσυστήματα σε όλη την Ελλάδα, επιλέχτηκε ως κωνοφόρο και ίσως, λόγω κατώτερης εξελικτικής βαθμίδας, ως περισσότερο ανθεκτικό. Τόσο η διαδικασία ακτινοβόλησης όσο και η μεθοδολογία προσέγγισης της επίδρασης της ακτινοβολίας δεν άλλαξαν. Τα ακτινοβολημένα φυτά φάνηκε να καθυστερούν την ανάπτυξή τους, και να εμφανίζουν χαμηλότερο νωπό βάρος και βιομάζα τόσο για το υπέργειο όσο και για το υπόγειο τμήμα τους. Παρουσίαζαν επίσης μείωση των φωτοσυνθετικών χρωστικών και αυξημένα επίπεδα ROS. Τα νεαρά φύλλα τους, οι βλαστοί και οι ρίζες δεν φαίνεται να έχουν διαφορές αν συγκριθούν με τα αντίστοιχα από τα φυτά-μάρτυρες. Όμως οι χλωροπλάστες των ακτινοβολημένων φύλλων, ειδικά στα κύτταρα της περιφέρειας, φαίνεται να παρουσιάζουν σοβαρές παραμορφώσεις και αποδιοργάνωση. Οι σημαντικές βλάβες στους χλωροπλάστες ευθύνονται για την μείωση των φωτοσυνθετικών χρωστικών, τη συρρίκνωση του φωτοσυνθετικού δυναμικού και την χαμηλή παραγωγικότητα που καταγράφηκε για τα ακτινοβολημένα νεαρά φυτά.Τέλος, στη γνωστή μυρτιά (Myrtus communis L.), ένα αείφυλλο σκληρόφυλλο είδος που απαντάται στα Μεσογειακά οικοσυστήματα, μελετήθηκε η επίδραση του "νέφους" της ΗΜΑ που καλύπτει πλέον τις περισσότερες περιοχές της χώρας λόγω της ραγδαίας, ευρύτατης εξάπλωσης της κινητής τηλεφωνίας. Παρ’ ότι τα φύλλα του φυτού που υπέστησαν την έκθεση στην ακτινοβολία κινητού τηλεφώνου, μορφολογικά, είναι απαράλλαχτα από τα φύλλα-μάρτυρες, στο μεσόφυλλό τους αποθηκεύουν μεγάλες ποσότητες δευτερογενών μεταβολιτών, οι φωτοσυνθετικές χρωστικές τους υφίστανται δραστική μείωση, η οξειδωτική καταπόνηση (ROS) αυξάνει σημαντικά ενώ καταγράφεται η παρουσία, σε υψηλές συγκεντρώσεις, του ενζύμου DDC, το οποίο δεν είναι δυνατόν να ανιχνευτεί, ούτε στο ελάχιστο, στα κύτταρα-μάρτυρες. Είναι πιθανόν ότι, η σημαντική καταπόνηση που υφίστανται τα ακτινοβολημένα κύτταρα, οδηγεί στην σύνθεση της DDC προφανώς για να διαχειριστεί την αυξημένη συγκέντρωση του υποστρώματος του ενζύμου, δηλαδή της ντοπαμίνης. Η σύνθεση, μιας φαινολικής προέλευσης ένωσης (κατεχολαμίνη) η οποία λειτουργεί ως νευροδιαβιβαστής στους ζωικούς οργανισμούς, όταν το φυτικό κύτταρο υποστεί την καταπόνηση της GSM ΗΜΑ, αξιολογείται ως ιδιαίτερα σημαντική και χρήζει περαιτέρω διερεύνησης. Έτσι, σε όλους τους φυτικούς οργανισμούς που μελετήθηκαν, διαπιστώθηκε η αύξηση των δραστικών μορφών οξυγόνου η οποία, ενδεχόμενα, αποτελεί την πρωταρχική αντίδραση και των φυτικών κυττάρων στην ΗΜΑ.Συμπερασματικά μπορούμε να διατυπώσουμε την άποψη ότι η μη-ιονίζουσα ΗΜΑ που εκπέμπεται από συσκευής ευρύτατης, καθημερινής χρήσης, μόνον αθώα δεν μπορεί να θεωρηθεί, αφού προκαλεί βλάβες τόσο στα ζωικά όσο και στα φυτικά κύτταρα που μελετήθηκαν.