Επίδραση Των Φαρμάκων Για Την Πνευμονική Υπέρταση Στην Έκφραση Των Γλυκοζαμινογλυκανών Και Μεταλλοπρωτεασών Σε Προωτογενείς Καλλιέργειες Λείων Μυϊκών Κυττάρων Πνευμονικής Αρτηρίας Ανθρώπων

Abstract

Η παρούσα διατριβή αφορά στη διερεύνηση της παθοφυσιολογίας της ιδιοπαθούς πνευμονικής υπέρτασης (IPAH), μιας σπάνιας ασθένειας με ιδιαίτερα βαρεία νοσηρότητα και θνητότητα. Κατά την τελευταία 20ετία έχει επιτευχθεί μεγάλη πρόοδος όσον αφορά στην κατανόηση της παθοφυσιολογίας της νόσου, η οποία αντικατοπτρίζεται στη βελτίωση της έγκαιρης διάγνωσης των ασθενών και της φαρμακοθεραπείας. Η επικρατούσα ειδική φαρμακευτική αγωγή βασίζεται κατά κύριο λόγο στην ενίσχυση της δράσης του ΝΟ (π.χ. σιλδεναφίλη) και της προστακυκλίνης και στην αναστολή της δράσης της ενδοθηλίνης-1 (π.χ. μποσεντάνη). Ένα από τα πεδία που παραμένει ακόμη να διευκρινιστεί είναι η συμβολή των μορίων του εξωκυττάριου χώρου στην ιστική αναδόμηση που παρατηρείται στην IAPH, δεδομένου ότι μόρια του εξωκυττάριου χώρου όπως οι γλυκοζαμινογλυκάνες (GAG), οι πρωτεογλυκάνες (PG) και οι μεταλλοπρωτεάσες του συνδετικού ιστού (MMP) εμπλέκονται στην ιστική αναδόμηση και έχει αναφερθεί ότι σχετίζονται με άλλες παθήσεις των πνευμόνων που εμφανίζουν ιστική αναδόμηση. Στην παρούσα διατριβή διερευνήθηκε ο ρόλος των GAG, PG και MMP στην IPAH. Η μελέτη έγινε σε ομογενοποιημένο πνευμονικό ιστό και σε πρωτογενείς καλλιέργειες λείων μυϊκών κυττάρων από πνευμονικές αρτηρίες (pulmonary artery smooth muscle cells, PASMC) που ελήφθησαν από 12 ασθενείς με IPAH και από 10 υγιείς δότες οργάνων. Στα PASMC μελετήθηκε, επίσης, η επίδραση των φαρμάκων μποσεντάνη και σιλδεναφίλη στην έκφραση των GAG, PG και MMP, καθώς και η η επίδραση του μετασχηματίζοντος αυξητικού παράγοντα-β1 (TGF-β1) και της μορφογενετικής πρωτεΐνης των οστών-2 (BMP-2). Οι 2 αυτοί αυξητικοί παράγοντες αποτελούν βασικούς ρυθμιστές της σύνθεσης μορίων του ECM και εμπλέκονται άμεσα στην παθοφυσιολογία της IPAH. Το σύστημα αυτό αποτελεί την πλέον κοντινή προσομοίωση σε πειραματικό μοντέλο της αναδιαμόρφωσης των ιστών που σχετίζεται με την IPAH. Διαπιστώθηκε ότι τα δείγματα πνευμονικού ιστού και τα PASMC εκφράζουν τις GAG: ΗΑ, θειική ηπαράνη, θειική δερματάνη και θειική χονδροϊτίνη. Παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική αύξηση του ΗΑ και μείωση της θειικής ηπαράνης, θειικής δερματάνης και θειικής χονδροϊτίνης στους πνεύμονες ασθενών με IPAH. Επίσης, διαπιστώθηκε ότι η μοριακή μάζα του ΗΑ από πνευμονικό ιστό από μάρτυρες έχει ΜΒ μεγαλύτερο από 1000 kDa, ενώ το ΗΑ από ασθενείς με IPAH υπολογίσθηκε σε περίπου 200 kDa. Οι διαφορές αυτές στα επίπεδα ΗΑ οφείλονται στη διαφοροποίηση της έκφρασης των ενζύμων που μεταβολίζουν το ΗΑ. Τα δείγματα πνευμονικού ιστού και PASMC εκφράζουν τα ένζυμα που συνθέτουν το ΗΑ: Has1, Has2 και Has3 καθώς και τα ένζυμα που αποδομούν το ΗΑ: Hyal1, Hyal2, Hyal3 και Hyal4, καθώς και τους υποδοχείς του ΗΑ CD44 και Rhamm. Η έκφραση και τα επίπεδα πρωτεΐνης της HAS1 είναι στατιστικά σημαντικά αυξημένη, ενώ η έκφραση της HYAL1 είναι στατιστικά σημαντικά μειωμένη στους ασθενείς με IPAH. Τα αποτελέσματα ενισχύουν τη θεωρία ότι το ΗΑ μεγάλου μοριακού βάρους σχετίζεται με φυσιολογικές διεργασίες, ενώ το μικρού μοριακού βάρους ΗΑ με φλεγμονώδεις καταστάσεις. Στο πειραματικό μοντέλο προσομοίωσης της αναδιαμόρφωσης των ιστών που σχετίζεται με την IPAH, διαπιστώθηκε ότι η προσθήκη τόσο του TGF-β1, όσο και της BMP-2 σε φυσιολογικά PASMC, προκαλούν δοσοεξαρτώμενη και χρονοεξαρτώμενη διαφοροποίηση της έκφρασης GAG, HA και HAS-1, παρόμοια με αυτήν που παρατηρήθηκε σε ασθενείς με IPAH. Η ενδοκυττάρια μετάδοση σήματος του TGF-β1 στη de novo σύνθεση, έκκριση και εναπόθεση GAG από PASMC διαπιστώθηκε ότι μεσολαβείτε μέσω SMAD και p38 MAPK σηματοδοτικών μονοπατιών. Σε σχέση με τις πρωτεογλυκάνες, διαπιστώθηκε ότι τα δείγματα πνευμονικού ιστού μαρτύρων και ασθενών με IPAH καθώς και τα PASMC εκφράζουν τη βερσικάνη, διγλυκάνη, ντεκορίνη, περλεκάνη και συνδεκάνη και παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική μείωση στην έκφραση βερσικάνης V1 και της ντεκορίνης στους ασθενείς με IPAH. Διαπιστώθηκε, επίσης, ότι ο TGF-β1 επάγει κατά δοσοεξαρτώμενο και χρονοεξαρτώμενο τρόπο την έκφραση της βερσικάνης V0 και V1, διγλυκάνης, περλεκάνης και συνδεκάνης και μειώνει την έκφραση της ντεκορίνης. Παρόμοια, διαπιστώθηκε ότι η BMP-2 προκαλεί χρονοεξαρτώμενη επαγωγή της έκφρασης της βερσικάνης V0 και V1, της περλεκάνης και της συνδεκάνης. Η επαγωγή της έκφρασης των συγκεκριμένων πρωτεογλυκανών που προκαλεί ο TGF-β1 και η BMP-2 ενδεχομένως σχετίζεται με την αναδόμηση του πνευμονικού ιστού που παρατηρείται στην IPAH. Όσον αφορά στην επίδραση των φαρμάκων σιλδεναφίλη και μποσεντάνη, διαπιστώθηκε ότι δεν επηρεάζουν σημαντικά στα PASMC τα επίπεδα HA, την έκφραση Has, Hyal, CD44 και RHAMM και τη δραστηριότητα και επίπεδα MMP και TIMP. Διαπιστώθηκε, όμως ότι τα εν λόγω φάρμακα ή ο συνδυασμός τους μειώνουν την επαγόμενη από τον TGF-β1 ή την BMP-2 έκφραση των γονιδίων των πρωτεογλυκανών βερσικάνης V0, βερσικάνης V1, διγλυκάνης, περλεκάνης και συνδεκάνης στα PASMC, αλλά η μείωση αυτή δεν είναι στατιστικά σημαντική. Τα αποτελέσματα της παρούσης διατριβής υποδεικνύουν ότι τα μόρια του εξωκυττάριου χώρου, όπως οι γλυκοζαμινογλυκάνες και ιδιαίτερα το υαλουρονικό οξύ, οι πρωτεογλυκάνες και οι ζελατινάσες εμπλέκονται στην παθοφυσιολογία της IPAH και θα μπορούσαν να αποτελέσουν δυνητικούς φαρμακολογικούς στόχους στην αντιμετώπιση της ανίατης και θανατηφόρου αυτής ασθένειας. Η επίδραση των φαρμάκων σιλδεναφίλη και μποσεντάνη, τα οποία χορηγούνται στη IPAH, υποδεικνύει ενδεχόμενα ευεργετικά αποτελέσματα λόγω της προκαλούμενης επαναφοράς σε φυσιολογικά επίπεδα της γονιδιακής έκφρασης των πρωτεογλυκανών, αλλά η στατιστική τους σημαντικότητα παραμένει να αποδειχθεί σε μεγαλύτερο αριθμό ασθενών.