Έκφραση Της Λεπτίνης Και Των Υποδοχέων Της Σε Περιφερικούς Ιστούς

Abstract

Κατά την ανακάλυψή της το 1994 από τον Ζhang και τους συνεργάτες του, η λεπτίνη, το πρωτεϊνικό προϊόν του ob γονιδίου, συσχετίστηκε αποκλειστικά με τη ρύθμιση του μεταβολισμού και του ενεργειακού ισοζυγίου του οργανισμού, πράγμα που προδίδει και η ετυμολογία του όρου. Πέραν της κεντρικής δράσης της όμως, με την πάροδο των ετών αποδείχτηκε πως έχει ένα ευρύτατο φάσμα ρυθμιστικών ρόλων με πολλούς ιστούς αποδέκτες μιας και έχει διαπιστωθεί η συμμετοχή της στην ανάπτυξη των ενδοθηλιακών κυττάρων και την αγγειογένεση, στην ενεργοποίηση του συμπαθητικού συστήματος, στην οξείδωση των ελεύθερων λιπαρών οξέων στους σκελετικούς μύες, στην ανάπτυξη και αναμόρφωση των οστών, στην αναπαραγωγή, στην αιμοποίηση, καθώς και στην ανοσολογική απόκριση και φλεγμονή.Τα τελευταία χρόνια η επιστημονική έρευνα έχει αναδείξει τον ανοσορυθμιστικό ρόλο της λεπτίνης ως σημαντικό μηχανισμό που ενέχεται στις διαδικασίες ίνωσης του ήπατος, καθώς και της συντήρησης της χρόνιας φλεγμονής σε αυτό. Πέραν τούτου ισχυροποιείται η συσχέτιση που φαίνεται να έχει η παχυσαρκία και συνεπώς οι κυτταροκίνες του λιπώδους ιστού, μεταξύ αυτών και η λεπτίνη, με τους μηχανισμούς ογκογένεσης σε πολλούς ιστούς του ανθρώπινου σώματος, όπως ο μαστός, το παχύ έντερο, ο προστάτης, το ενδομήτριο, η ωοθήκη, το ήπαρ κ.α.Οι ισχυρές βιβλιογραφικές ενδείξεις για τον πολυσχιδή ρόλο της λεπτίνης μας ώθησαν στην αναζήτηση στοιχείων που πιστοποιούν τον ανοσορυθμιστικό και καρκινογενετικό ρόλο της στις χρόνιες ιογενείς ηπατοπάθειες και την αποσαφήνιση των μοριακών εκείνων μηχανισμών που διεκπεραιώνουν τις δράσεις της στο ήπαρ. Κομβικό σημείο της παρούσας έρευνας αποτέλεσε η στοιχειοθέτηση της καταλυτικής υπομονάδας του ενζύμου της τελομεράσης (hTERT) ως στόχου της λεπτίνης στον ηπατικό ιστό.Ειδικότερα παρατηρήσαμε, σε επίπεδο mRNA και πρωτεΐνης, σημαντικά χαμηλότερα επίπεδα έκφρασης των OB-Rl και OB-Rs στα περιφερικά μονοπύρηνα κύτταρα του αίματος ασθενών με HBV και HCV λοίμωξη συγκριτικά με τους υγιείς και τους ασθενείς με μη ιογενούς αιτιολογίας ηπατοπάθεια. Η παρατηρούμενη αυτή μείωση της επιφανειακής πρωτεΐνης του OB-R στα δείγματα των ασθενών με HBV, HCV λοίμωξη θα μπορούσε να αντικατοπτρίζει μια επαγόμενη από τους ιούς μοριακή δυσλειτουργία ή αυξημένη ευαισθησία στις διαδικασίες απόπτωσης των PBMCs, που ως τελικό αποτέλεσμα θα έχει την μείωση ή την πλήρη καταστολή της μετάφρασης. Προτείνουμε τη συμμετοχή των OB-Rl, OB-Rs στην ανοσολογική δυσλειτουργία που παρατηρείται στους ασθενείς με χρόνιες HBV, HCV λοιμώξεις, αφού μειωμένη έκφραση των υποδοχέων στην κυτταρική επιφάνεια των περιφερικών μονοπύρηνων κυττάρων του αίματος αφαιρεί από τη λεπτίνη την δυνατότητα διέγερσης των PBMCs, μειώνει τον αριθμό τον ανοσολογικών κυττάρων και πιθανά αυξάνει το κλάσμα των ανοσοκυττάρων που περιέρχονται σε φάση απόπτωσης.Ένα ακόμα εύρημα του πρώτου κύκλου της παρούσας διδακτορικής διατριβής αποτέλεσε η θετική συσχέτιση στην έκφραση μεταξύ του OB-Rl και OB-Rs (ο OB-Rs εκφράζεται σταθερά σε περίπου διπλάσιο ποσό σε σχέση με τον OB-Rl) στο σύνολο των δειγμάτων της μελέτης που αφορούσε στα PBMCs. Πρόκειται για ένα στοιχείο που αναδεικνύει ένα σταθερό και παράλληλο πρότυπο έκφρασης των δύο υποδοχέων και πιθανά αποτελεί ένδειξη ότι ο λιγότερο λειτουργικός OB-Rs ευοδώνει τη δράση του λειτουργικού OB-Rl ή ρυθμίζει τα επίπεδα της κυκλοφορούσας στον ορό λεπτίνης ή συμβάλλει στη μεταφορά της λεπτίνης σε ενδοκυττάρια διαμερίσματα. Η υψηλή θετική συσχέτιση του OB-Rs με την ηλικία στο σύνολο των δειγμάτων μας κατευθύνει υπέρ της ισχυρής εξάρτησης που μπορεί να υπάρχει μεταξύ της ικανότητας ανοσολογικής απόκρισης του οργανισμού και της ηλικίας.Επίσης, ανιχνεύσαμε έκφραση του mRNA της λεπτίνης στα PBMCs μικρού αριθμού δειγμάτων από την ομάδα με HCV λοίμωξη και μεγάλου αριθμού από τα δείγματα των ασθενών με μη ιογενείς ηπατοπάθειες. Η αύξηση αυτή της έκφρασης της λεπτίνης συνδυαζόμενη με την αύξηση της έκφρασης των υποδοχέων της, σε επίπεδο mRNA και πρωτεΐνης, στους ασθενείς με μη ιογενούς αιτιολογίας ηπατοπάθειες υποστηρίζει την ύπαρξη ενός μηχανισμού αυτοκρινούς ανατροφοδότησης που εκπορεύεται από τη λεπτίνη στα PBMCs. Αυτός ο μηχανισμός εξηγεί επίσης και την ανοσοδιέγερση, απόρροια της οποίας είναι η ηπατική κυτταροτοξικότητα, που παρατηρείται στην αυτοάνοση και αλκοολική ηπατίτιδα. Σε ό,τι αφορά στα επίπεδα της λεπτίνης του ορού των ασθενών με χρόνιες ιογενείς ηπατοπάθειες υπάρχουν αντικρουόμενα ευρήματα στη διεθνή βιβλιογραφία. Τα ευρήματα της παρούσας διατριβής υποστηρίζουν ότι τα επίπεδα της λεπτίνης του ορού των ασθενών με ιογενείς ηπατίτιδες (B και C) ή ηπατική κίρρωση είναι χαμηλότερα σε σχέση με αυτά των υγειών. Επιχειρώντας να ερμηνεύσουμε τα αποτελέσματά μας οδηγηθήκαμε στο συμπέρασμα ότι η μείωση της έκκρισης της λεπτίνης από το λιπώδη ιστό αποτελεί μέρος ενός μηχανισμού ανατροφοδότησης που επιχειρεί να απαντήσει στο αρνητικό ενεργειακό ισοζύγιο που χαρακτηρίζει την πορεία των χρόνιων ιογενών ηπατοπαθειών. Επειδή οι χρόνιες ηπατοπάθειες προσφέρουν ένα περιβάλλον μιτογόνο αλλά και μεταλλαξιγόνο, το οποίο είναι σε θέση να αλληλεπιδράσει και να διαφοροποιήσει το επίπεδο έκφρασης των γονιδίων στο ηπατοκύτταρο αποφασίσαμε να υπερσκελίσουμε την κεντρικώς παραγόμενη λεπτίνη και να εστιάσουμε στην τοπική έκφρασή της στο μικροπεριβάλλον του ήπατος. Παρατηρήσαμε ότι τόσο η παραγωγή της λεπτίνης όσο και η έκφραση των υποδοχέων της (OB-Rl, OB-Rs) έβαιναν αυξανόμενες κατά τη μετάπτωση από το υγιές ήπαρ αρχικά σε φλεγμαίνον, υπό το καθεστώς χρόνιας ιογενούς ηπατίτιδας, και τελικά σε ηπατοκυτταρικό καρκίνο. Φαίνεται ότι η λεπτίνη όχι μόνο ευνοεί τις διαδικασίες ίνωσης και φλεγμονής, αλλά συμβάλλει αποφασιστικά στην εγκαθίδρυση ενός μεταλλαξιγόνου περιβάλλοντος στο ήπαρ ασθενών με HBV και HCV λοίμωξη.Το γεγονός όμως ότι τα υψηλά επίπεδα έκφρασης της λεπτίνης και των υποδοχέων της σε ηπατικό ιστό από ΗΚΚ δε διαπιστώσαμε να συσχετίζονται με το ΒΜΙ των ασθενών, μας οδήγησε στην υπόθεση ότι η παραγωγή λεπτίνης στο ήπαρ αυτών των ασθενών δε ρυθμίζεται απευθείας από τα αποθέματα λίπους του οργανισμού, αλλά αντικατοπτρίζει και καθορίζεται από τις μοριακές αλληλεπιδράσεις που λαμβάνουν χώρα στο ογκογενετικό μικροπεριβάλλον του ήπατος. Μπορεί, λοιπόν, η κυκλοφορούσα λεπτίνη, το ποσό της οποίας καθορίζεται από το ΒΜΙ, να ευοδώνει τη φλεγμονώδη διήθηση και ίνωση του ήπατος κατά τις χρόνιες ιογενείς ηπατοπάθειες, αλλά κομβικό σημείο που προάγει τη μεταλλαξιγόνο διαδικασία και καθορίζει την εδραίωση του ΗΚΚ φαίνεται να είναι η τοπική παραγωγή λεπτίνης στο ηπαποκύτταρο.Στον άνθρωπο η γένεση του ΗΚΚ είναι αποτέλεσμα μιας πολυπαραγοντικής διαδικασίας που περιλαμβάνει γενετικές και επιγενετικές τροποποιήσεις οι οποίες λαμβάνουν χώρα σε πληθώρα γονιδίων στα ηπατοκύτταρα. Μεταξύ των παραπάνω γονιδίων είναι και το γονίδιο που κωδικοποιεί τη σύνθεση της καταλυτικής υπομονάδας της τελομεράσης (hTERT), το οποίο μάλιστα είναι το μόνο εξ αυτών που παρουσιάζει μηδενική έκφραση στα φυσιολογικά ηπατοκύτταρα. Ο ρόλος της τελομεράσης στις χρόνιες ιογενείς ηπατοπάθειες και στη μετεξέλιξή τους σε κακοήθεια, καθώς και η διαφαινόμενη θέση του συστήματος της λεπτίνης στη φλεγμονή του ήπατος και το ΗΚΚ, μας ώθησαν στην αναζήτηση της πιθανής συσχέτισης μεταξύ τους σε μοριακό επίπεδο, όπως και του μηχανισμού αλληλεπίδρασης τους εντός του ηπατικού παρεγχύματος. Σε αυτή την κατεύθυνση ενδιαφέρον εύρημά μας υπήρξε η υψηλή συσχέτιση της λεπτίνης τόσο με την hTERT όσο και με την δραστικότητα της τελομεράσης μόνο στα δείγματα ηπατικού ιστού με ΗΚΚ. Επιπλέον, διαπιστώσαμε ότι η λεπτίνη ήταν ικανή για απευθείας θετική επίδραση στην έκφραση του mRNA της hTERT και τη δραστικότητα της τελομεράσης στα HepG2 κύτταρα.Η αρχική μας διαπίστωση ότι η λεπτίνη αποτελεί ρυθμιστή της έκφρασης της hTERT και στον ηπατικό ιστό, μας ώθησε στο να εμβαθύνουμε σε ό,τι αφορά στο μοριακό μηχανισμό ενδοκυττάριας μεταγωγής σήματος που κινητοποιείται από τη λεπτίνη και ενεργοποιεί ή αναστέλλει τη γονιδιακή έκφραση της hTERT. Ο υποκινητής της hTERT περιέχει πληθώρα περιοχών πρόσδεσης για μεταγραφικούς παράγοντες μεταξύ των οποίων είναι διάφοροι ενεργοποιητές, όπως οι c-myc, Sp1 και STAT3 και καταστολείς, όπως οι mad1 και p53 που καθορίζουν την έκφρασή της σε μεταγραφικό επίπεδο.Συνυπολογίζοντας τα ανωτέρω, εφαρμόσαμε τη μέθοδο της ανοσοκατακρήμνισης της χρωματίνης ώστε να ερευνήσουμε το κατά πόσο η λεπτίνη ευοδώνει την πρόσδεση του STAT3 στον υποκινητή της hTERT και στα HepG2 κύτταρα. Βρήκαμε ότι η χορήγηση λεπτίνης, βραχυπρόθεσμα ή μακροχρόνια, αυξάνει την πρόσδεση του STAT3 σε δύο θέσεις του υποκινητή της hTERT. Αυτό μας το εύρημα αποσαφηνίζει ότι ο άξονας λεπτίνη-υποδοχέας λεπτίνης-STAT3-hTERT έχει ρόλο στις διαδικασίες εγκαθίδρυσης και εδραίωσης της καρκινικής μεταλλαγής στο ηπατοκύτταρο.. Το αυξανόμενο ενδιαφέρον και οι ισχυρές ενδείξεις για το σημαντικό ρόλο διάφορων γενετικών και επιγενετικών μηχανισμών ρύθμισης της έκφρασης της hTERT στα κύτταρα, μας οδήγησαν σε πιο ενδελεχή έλεγχο και αξιολόγηση του βαθμού πρόσδεσης των Myc, Max, Mad και της ακετυλιωμένης Η3 ιστόνης στον υποκινητή της hTERT μετά τη χορήγηση λεπτίνης. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή δείξαμε για πρώτη φορά υψηλή συσχέτιση της μετάπτωσης από το Mad1/Max πρότυπο πρόσδεσης σε Myc/Max πρότυπο με την ενεργοποίηση της μεταγραφής του hTERT γονιδίου μετά τη χορήγηση λεπτίνης στα HepG2 κύτταρα. Επιπλέον μετά από μακροχρόνια χορήγηση λεπτίνης για διάστημα 2 μηνών διαπιστώσαμε ακόμα μεγαλύτερα επίπεδα πρόσδεσης του Myc/Max συμπλόκου στον υποκινητή του hTERT, τα οποία αυτή τη φορά συνοδεύονταν από αύξηση της ακετυλίωσης της ιστόνης Η3. Εφόσον όμως η μακροχρόνια χορήγηση λεπτίνης δεν πέτυχε να αυξήσει τα επίπεδα mRNA της hTERT ούτε την ΤΑ υποθέτουμε ότι η λεπτινοεξαρτημένη υπερέκφραση της hTERT βρίσκεται υπό ένα διαρκή έλεγχο από διάφορους μετα-μεταγραφικούς μοριακούς ρυθμιστές. Καταλήξαμε επίσης στο συμπέρασμα ότι η αλληλουχία δράσης των διάφορων μεταγραφικών παραγόντων και επιγενετικών μηχανισμών έχει ισχυρή εξάρτηση από το χρόνο δράσης της λεπτίνης στο ηπατοκύτταρο.Καθώς η λεπτινο-εξαρτημένη υπερέκφραση της hTERT μπορεί να οδηγήσει σε ογκογόνο ανάπτυξη και απορρύθμιση του κυτταρικού κύκλου ερευνήσαμε στη συνέχεια την επίδραση της λεπτίνης στον πολλαπλασιασμό και τη βιωσιμότητα των HepG2 κυττάρων. Λεπτομερέστερα, η λεπτίνη διέγειρε την ανάπτυξη των HepG2 κυττάρων σύμφωνα με ένα χρόνο- και δόσο-εξαρτημένο πρότυπο.Τα τελευταία χρόνια ισχυροποιούνται συνεχώς οι ενδείξεις ότι η φλεγμονή αποτελεί σημαντική προϋπόθεση για την έναρξη, εγκατάσταση και πρόοδο των όγκων στο ήπαρ. Ο πιθανός ρόλος των φλεγμονωδών κυτταροκινών στην ανάπτυξη και εξάπλωση των καρκινικών κυττάρων μας οδήγησε στη μελέτη της επίδρασης της λεπτίνης στην παραγωγή IL-1, IL-6 και TGF-β1 από τα ανθρώπινα ηπατοκαρκινικά κύτταρα. Σε αυτό τον κύκλο πειραμάτων βρέθηκε ότι η χορήγηση λεπτίνης σε HepG2 κύτταρα αύξησε την παραγωγή της IL-6 και κατέστειλε την παραγωγή του TGF-β1 με ένα χρόνο- και δόσο-εξαρτημένο πρότυπο, ενώ αντίθετα δεν επηρέασε καθόλου τις IL-1a και IL-1β. Προτείνεται έτσι μια επιπλέον εναλλακτική οδός επιρροής της λεπτίνης επί της hTERT που δεν περιλαμβάνει την διαμεσολάβηση του OB-R και του JAK/STAT3 μοριακού μονοπατιού, αλλά της IL-6 και του μοριακού μονοπατιού PI3K/AKT.Παρατηρήσαμε επίσης ότι η λεπτίνη ήταν ικανή να καταστείλει την έκφραση της MMP-1 και να διεγείρει περαιτέρω την έκφραση των MMP-9 και -13, ενώ η χρήση siRNA για την λεπτίνη είχε ακριβώς τα αντίθετα αποτελέσματα, πράγμα που την καθιστά ρυθμιστή της δημιουργίας ενός μικροπεριβάλλοντος που ευνοεί τη διείσδυση και μετάσταση του ΗΚΚ στο κιρρωτικό ήπαρ.Έτσι, μετά από ένα κύκλο πειραμάτων που μας βοήθησαν να διακρίνουμε τους μοριακούς μηχανισμούς που επάγονται ή αναστέλλονται από την λεπτίνη στο ηπατοκαρκινικό κύτταρο, στη συνέχεια επιδιώξαμε να αποσαφηνίσουμε αν η έκφραση της λεπτίνης ελέγχεται από την πρόσδεση της ακετυλιωμένης Η3 ιστόνης στο δικό της υποκινητή. Σε αυτό μας το εγχείρημα μας βοήθησε η τριχοστατίνη Α (TSA), ένας αναστολέας της αποακετυλίωσης των ιστονών. Βρέθηκε έτσι, ότι ενώ πριν τη χορήγηση TSA στα HepG2 η πρόσδεση της ακετυλιωμένης Η3 στον υποκινητή της λεπτίνης ήταν μηδενική, μετά την προσθήκη της TSA παρατηρήθηκε ισχυρό σήμα των ανοσοκατακρημνισμάτων της. Τέλος βρέθηκε ότι η IL-6 προκαλεί αύξηση στην παραγωγή της λεπτίνης και με το ίδιο πρότυπο αύξηση και στην έκφραση του mRNA της hTERT, καθώς και στην ενεργότητα της τελομεράσης. Καθίσταται σαφής έτσι ο διαδραστικός χαρακτήρας της σχέσης μεταξύ λεπτίνης και IL-6 στο ογκογόνο μικροπεριβάλλον του ήπατος με τελική κατάληξη την ενεργοποίηση της καταλυτικής υπομονάδας της τελομεράσης. Τα ανωτέρω ευρήματα καθιστούν την hTERT γονίδιο στόχο για την λεπτίνη στα ηπατοκαρκινικά κύτταρα και ισχυροποιούν περαιτέρω τον κομβικό ρόλο του συστήματος της λεπτίνης στην μακρόχρονη και πολυσχιδή διαδικασία της ογκογένεσης στο χρονίως φλεγμαίνον ήπαρ. Επιπλέον συμβάλλουν σημαντικά στη διαλεύκανση των μοριακών εκείνων μηχανισμών που κινητοποιούν γενετικές και επιγενετικές αλληλεπιδράσεις και διαμεσολαβούν τον ανοσολογικό και καρκινογενετικό ρόλο της λεπτίνης στο μικροπεριβάλλον του ήπατος.