Διερεύνηση του ρόλου των γονιδίων του πρωτογενούς μεταβολισμού στην ανθεκτικότητα των φυτών στο μύκητα Fusarium oxysporum

Abstract

Τα παθογόνα στελέχη του εδαφογενούς μύκητα Fusarium oxysporum sensu stricto προσβάλλουν πολλά διαφορετικά είδη φυτών προκαλώντας ζημιές σε καλλιέργειες μεγάλης οικονομικής σημασίας, με σοβαρές οικονομικές και κοινωνικές επιπτώσεις. Στην παρούσα μελέτη, διερευνήθηκε ο ρόλος των γονιδίων του πρωτογενούς μεταβολισμού και συγκεκριμένα της β-αμυλόλυσης στην άμυνα φυτών Arabidopsis thaliana έναντι του φυτοπαθογόνου μύκητα F. oxysporum f. sp. raphani (For). Σε δοκιμές παθογένειας αξιολογήθηκε η ευπάθεια φυτών A. thaliana, γενετικά τροποποιημένων στα γονίδια που κωδικοποιούν τις τέσσερις χλωροπλαστικές β-αμυλάσες, BAM1, BAM2, BAM3 και BAM4, και των συνδυασμών τους στη μόλυνση με το For σε σχέση με τα φυτά αγρίου τύπου (wt). Από όλες τις εξετασθείσες bam σειρές, τα φυτά με τη γενετική τροποποίηση στο BAM3 γονίδιο, που κωδικοποιεί το βασικότερο υδρολυτικό ένζυμο αποδόμησης του αμύλου, παρουσίασαν τη μικρότερη ευπάθεια στο For και στους ιστούς αυτών ανιχνεύτηκε η μικρότερη ποσότητα DNA του μύκητα με τη μέθοδο real-time PCR. Η μεταγραφομική και μεταβολομική ανάλυση με τη χρήση της τεχνολογίας των DNA μικροσυστοιχιών και της αέριας χρωματογραφίας-φασματομετρίας μάζας (GC/MS), αντίστοιχα, έδειξε ότι τόσο τα αμόλυντα όσο και τα μολυσμένα με το For wt και bam3 φυτά διέφεραν σε γονίδια και μεταβολίτες που σχετίζονται με το μεταβολισμό των υδατανθράκων, των αμινοξέων, τις φυτικές ορμόνες, τα κυτταρικά συστατικά και τις πρωτεΐνες του κυτταρικού τοιχώματος. Σχετικά με την αποδόμηση του αμύλου, μελετήθηκε η έκφραση των γονιδίων των β-αμυλασών BAM1, BAM2, BAM3 και BAM4, του ΑΜΥ3 που κωδικοποιεί την α-αμυλάση 3 οδηγώντας στο σχηματισμό γραμμικών και διακλαδισμένων ολιγοσακχαριτών, του ISA3 που κωδικοποιεί το ένζυμο για την υδρόλυση των σημείων διακλάδωσης και του DPE1 που κωδικοποιεί το D ένζυμο οδηγώντας σε παραγωγή γλυκόζης ή σε γραμμικούς ολιγοσακχαρίτες. Τα μεταγραφήματα του BAM3, που ήταν σημαντικά λιγότερα στα αμόλυντα bam3 φυτά σε σχέση με τα φυτά αγρίου τύπου λόγω της γενετικής τροποποίησης, αυξήθηκαν μετά τη μόλυνση με το For χωρίς να ξεπερνούν αυτά των wt. Τα παραπάνω συμφωνούν με τα αποτελέσματα της φωτομετρικής μέτρησης του αμύλου και της μαλτόζης στα φυτά των δύο γονοτύπων, σύμφωνα με τα οποία το παθογόνο προκάλεσε αύξηση της μαλτόζης και μείωση του αμύλου στα bam3 φυτά και αντιθέτως μείωση της μαλτόζης και αύξηση του αμύλου στα wt φυτά . Στα μολυσμένα bam3 φυτά αυξήθηκαν τα επίπεδα έκφρασης των ΒΑΜ1, BAM2, BAM4, AMY3, ISA3 και DPE1. Επομένως, η μόλυνση με το For επάγει τη ρύθμιση των ενζύμων της αποδόμησης του αμύλου οδηγώντας στην παραγωγή γλυκόζης και εν μέρει στην παραγωγή μαλτόζης στα bam3 φυτά. H ανάλυση του μεταβολισμού των υδατανθράκων έδειξε ότι στα πρώτα στάδια της μόλυνσης (3 μέρες μετά τη μόλυνση), τα bam3 φυτά περιείχαν λιγότερη D-γλυκόζη, η οποία στη συνέχεια (7 μέρες μετά τη μόλυνση) αυξήθηκε και ήταν περισσότερη σε σχέση με εκείνη των wt φυτών. Επίσης, η μόλυνση με το For αύξησε τη συγκέντρωση της σακχαρόζης, η οποία συμμετέχει στην άμυνα των φυτών έναντι των παθογόνων μέσω της υδρόλυσής της σε γλυκόζη, που με τη σειρά της ενεργοποιεί αμυντικές αποκρίσεις. Η μεταγραφική ρύθμιση των σχετιζόμενων με το μεταβολισμό της τρεχαλόζης γονιδίων TPS6 και TPP5 μετά τη μόλυνση των bam3 φυτών με το For οδήγησε σε μείωση της τρεχαλόζης στα φυτά του μεταλλάγματος, γεγονός που επιβεβαιώνεται από τα αποτελέσματα της μεταβολομικής ανάλυσης, και πιθανόν να παίζει σημαντικό ρόλο στην άμυνα των bam3 φυτών έναντι του For, καθόσον η τρεχαλόζη και η πρόδρομος ένωσης αυτής, 6-φωσφορική τρεχαλόζη (T6P), θεωρούνται σημαντικά μόρια μετάδοσης σήματος που ρυθμίζουν το ισοζύγιο των υδατανθράκων και τις αμυντικές αποκρίσεις των φυτών έναντι των καταπονήσεων. Η μυο-ινοσιτόλη, σημαντικό σάκχαρο λόγω της συμμετοχής του σε πολλές διαφορετικές αναπτυξιακές και φυσιολογικές διεργασίες των ευκαρυωτικών κυττάρων, είχε αυξημένη συγκέντρωση στα bam3 φυτά σε σχέση με τα wt, παρουσία και απουσία του μύκητα, ενώ η συγκέντρωση της D-φωσφορικής μυο-ινοσιτόλης μειώθηκε στα φυτά του μεταλλάγματος μετά τη μόλυνση με το For. Τα γονίδια που καταλύουν την οξείδωση της μυο-ινοσιτόλης, MIOX1 και MIOX2, υπερεκφράστηκαν περισσότερο στα bam3 μολυσμένα φυτά σε σχέση με τα wt, υποδηλώνοντας ότι η μόλυνση με το For ενισχύει την οξειδωτική οδό του σακχάρου στα φυτά του μεταλλάγματος, ενεργοποιώντας εναλλακτικές πηγές γλυκανών για τη διατήρηση της μεταβολικής ομοιόστασης και οδηγώντας στο σχηματισμό του D-γλυκουρονικού οξέος για τη σύνθεση της πηκτίνης, βασικού συστατικού του πρωτογενούς κυτταρικού τοιχώματος. Ο παραπάνω ισχυρισμός επιβεβαιώνεται από τα αποτελέσματα της μέτρησης της συγκέντρωσης του γαλακτουρονικου οξέος (GalA) (ισοδύναμo της πηκτίνης), η οποία ήταν μεγαλύτερη στα φυτά του μεταλλάγματος σε σχέση με τα wt φυτά, παρουσία και απουσία του παθογόνου. Η δοκιμή διάχυσης σε πήκτωμα αγαρόζης πρωτεϊνικών εκχυλισμάτων από wt και bam3 φυτά έδειξε ότι η δράση των πηκτινομεθυλεστερασών (PMEs) ήταν σημαντικά εντονότερη στα αμόλυντα bam3 φυτά, η οποία επιβεβαιώνεται από την υπερέκφραση των γονιδίων που κωδικοποιούν τις πηκτινομεθυλεστεράσες PME1, PME3 και PME41 (ATPMEPCRB) στα αμόλυντα bam3 φυτά σε σχέση με τα αμόλυντα wt φυτά. Η μόλυνση με το παθογόνο μείωσε τη δράση των PMEs στα πρώτα στάδια της μόλυνσης (3 μέρες μετά τη μόλυνση), μείωση η οποία φαίνεται ότι συσχετίζεται με την υποέκφραση του PME41 και την υπερέκφραση του PMEI7 που κωδικοποιεί τον παρεμποδιστή της πηκτινομεθυλεστεράσης 7. Επίσης, ο ανοσοεντοπισμός ομογαλακτουρονανών (βασικό συστατικό της πηκτίνης) με διαφορετικό βαθμό μεθυλίωσης (DM) στα τοιχώματα των κυττάρων των ιστών του στελέχους και του υποκοτυλίου έδειξε ότι τα αμόλυντα bam3 φυτά περιείχαν περισσότερη πηκτίνη, τόσο με χαμηλό DM όσο και με υψηλό DM. Το For προκάλεσε αύξηση της έντονα μεθυλιωμένης πηκτίνης και μείωση της λιγότερο μεθυλιωμένης πηκτίνης στα bam3 φυτά. Από τα παραπάνω συνάγεται το συμπέρασμα ότι η μειωμένη ευπάθεια στο For των bam3 φυτών σχετίζεται με την αύξηση της περιεκτικότητας της πηκτίνης των φυτών του μεταλλάγματος και τη ρύθμιση του βαθμού μεθυλίωσης αυτής μέσω της μεταγραφικής ρύθμισης των γονιδίων που κωδικοποιούν PMEs και παρεμποδοστές αυτών (PME41, PMEI7)οδηγώντας στην παραγωγή έντονα μεθυλιωμένης πηκτίνης, γεγονός που καθιστά τα κυτταρικά τοιχώματα των bam3 φυτών λιγότερο ευάλωτα στον μύκητα For. Επίσης, η μόλυνση των bam3 φυτών με το For διαφοροποίησε την έκφραση των XTH24, XTH31 και EXP8, που κωδικοποιούν ένζυμα χαλάρωσης του δικτύου κυτταρίνης-ξυλογλυκάνης. Συγκεκριμένα, το XTH31 υποεκφράστηκε στα bam3 φυτά και στους 2 χρόνους μετά τη μόλυνση με το παθογόνο και πιθανόν να περιορίζει τη χαλάρωση των κυτταρικών τοιχωμάτων των φυτών του μεταλλάγματος παρεμποδίζοντας την είσοδο του μύκητα. Όσον αφορά τις φυτορμόνες, η επαγόμενη από το σαλικυλικό οξύ (SA) οδός μεταγωγής σήματος φαίνεται να εμπλέκεται στην άμυνα των bam3 φυτών A. thaliana έναντι του For, αφού τα μεταγραφικά επίπεδα του γονίδιου PR1 (δείκτης ενεργοποίησης της επαγόμενης από το SA άμυνας) ήταν υψηλότερα στα φυτά του μεταλλάγματος σε σχέση με τα wt. Επίσης, η προκαλούμενη από το For υπερέκφραση των γονιδίων που σχετίζονται με την επαγόμενη από το αιθυλένιο (ET) οδό μεταγωγής σήματος PDF1.2, ACS8 και ERF11, και του MYC2 που κωδικοποιεί μεταγραφικό ρυθμιστή του μονοπατιού του ιασμονικού οξέος (JA) στα φυτά του μεταλλάγματος υποδηλώνει την πιθανή συνέργεια των μονοπατιών των SA και ET/JA στην άμυνα των bam3 φυτών έναντι του For. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της μεταβολομικής ανάλυσης, οι πρόδρομες ενώσεις του ινδολ-3-οξικού οξέος (ΙΑΑ), ινδολο-3-λακτικό οξύ και 1H-ινδολο-3-ακετονιτρίλιο, αυξήθηκαν σημαντικά στα μολυσμένα και αμόλυντα bam3 φυτά σε σχέση με τα αντίστοιχα wt. Επίσης, στα μολυσμένα φυτά του μεταλλάγματος αυξήθηκαν τα μεταγραφικά επίπεδα του GH3.3 που κωδικοποιεί τη συνδετάση που ενώνει το IAA με αμινοξέα, και του DRM2 που σχετίζεται με τη μεταφορά της αυξίνης. Δεδομένου ότι οι πρωτεΐνες GH3 συμβάλλουν στη διατήρηση της ομοιόστασης της αυξίνης οδηγώντας στην εξασθένιση του βοηθητικού προγράμματος ανάπτυξης προκειμένου να δοθεί προτεραιότητα σε αμυντικούς μηχανισμούς, και οι DRM πρωτεΐνες σχετίζονται με αμυντικές αποκρίσεις έναντι βιοτικών και αβιοτικών καταπονήσεων, ο μεταβολισμός της αυξίνης φαίνεται να εμπλέκεται στις αμυντικές αποκρίσεις των bam3 φυτών έναντι του For. Η παρούσα μελέτη έδειξε ότι η πρωτεΐνη BAM3 αποτελεί αρνητικό ρυθμιστή της ανθεκτικότητας έναντι του φυτοπαθογόνου μύκητα F. oxysporum και ως εκ τούτου θα μπορούσε να αξιοποιηθεί για τη δημιουργία ανθεκτικών στο F. oxysporum ποικιλιών. Η δε άμυνα των bam3 φυτών σχετίζεται με τη ρύθμιση των ενζύμων της αποδόμησης του αμύλου, τροποποιήσεις στο μεταβολισμό των σακχάρων (γλυκόζη, σακχαρόζη, τρεχαλόζη και μυο-ινοσιτόλη) και της αυξίνης, τη συνέργεια των επαγόμενων από SA και ET/JA οδών μεταγωγής σήματος και την ενίσχυση των κυτταρικών τοιχωμάτων σε πηκτίνη με υψηλό βαθμό μεθυλίωσης που καθιστά τα κυτταρικά τοιχώματα των φυτών του μεταλλάγματος λιγότερο ευάλωτα στην προσβολή από το παθογόνο.