Zelluläre Mikroskopie der Poly(ADP‐Ribos)ylierung von Proteinen in Echtzeit

Abstract

Poly(ADP-Ribos)ylierung (PARylierung) ist eine wichtige posttranslationale Proteinmodifikation,d ie in grundlegende zelluläre Prozesse wie Genregulation und DNA-Reparatur involviert ist. Ihre Fehlregulierung wurde mit verschiedenen Krankheiten wie Krebs in Verbindung gebracht. Trotz grçßter Wichtigkeit gibt es nur wenige Methoden, um PARylierung und ihre Dynamik in Zellen zu beobachten. Mittels einer chemisch-biologischen Herangehensweise entwickelten wir ein fluoreszierendes NAD + -Analogon, das sich als kompetitiver Baustein für die PARylierung von Proteinen in vitro und in Zellen erwies.D ies ermçglichte uns,d en Umsatz von PARd irekt und in lebenden Zellen nachD NA-Schädigung durchN IR-Mikrobestrahlung zu verfolgen. Zusätzlich wurden mithilfe von FLIM-FRET-Mikroskopie kovalente und nichtkovalente Interaktionen von PARm it ausgewählten Proteinen sichtbar gemacht. Unsere Ergebnisse erçffnen neue Chancen für die schnelle zelluläre Untersuchung der Protein-PARylierung in Echtzeit und werden somit zu einem besseren Verständnis und hçherer Aussagekraft im zellulären Kontext beitragen. Abbildung 1. Struktur von A) Poly(ADP-ribose) und B) NAD + und NAD + -Analoga 1 und 2,die in dieser Studie verwendet wurden.[ + + ]D iese Autoren haben zu gleichen Teilen zu der Arbeit beigetragen.Hintergrundinformationen zu diesem Beitrag sind unter: http://dx.

Functionalised Cofactor Mimics for Interactome Discovery and Beyond

“…[140] (cofactor deficiency) NAD + and NADP + Various biotin-, [82] alkyne-, [78] azide- [84] and photoaffinity-functionalised probes. [86,87] Various fluorophore probes [83,100,[104][105][106][107][108] Ref. [141] NCB10 (cardiovascular disease, Sadenosyl-L-homocysteine hydrolase) Pyridoxal phosphate (PLP)…”

“…[98,99] The linker approach was also utilised in the design of a TAMRA-functionalised NAD + mimic (4.5) which was accepted as a competitive substrate for protein PARylation in live cells, allowing real-time visualisation of the process by FRET-FLIM microscopy. [100] However, fluorophores can also be nested in the structure of the cofactor rather than appended via a linker. Classic examples of this include the numerous fluorescent adenosine analogues developed and applied to generate fluorescent mimics of ATP, [93,101] SAM, [102,103] and NAD [104][105][106][107][108] (4.2-4.4; reviewed elsewhere [81] ).…”

Funktionalisierte Cofaktor‐Analoga für die Erforschung von Interaktomen und darüber hinaus

“…[98,99] Der Linker-Ansatz wurde auch bei der Entwicklung eines TAMRA-funktionalisierten NAD + -Analogons (4.5) verwendet, das als kompetitives Substrat für die Protein-PARylierung von lebenden Zellen akzeptiert wurde und die Echtzeit-Visualisierung des Prozesses durch FRET-FLIM-Mikroskopie ermöglichte. [100] Fluorophore können statt über einen Linker auch in die Struktur des Cofaktors eingebettet werden. Klassische Beispiele hierfür sind die zahlreichen fluoreszierenden Adenosin-Analoga, die entwickelt wurden, um fluoreszierende Analoga von ATP, [93,101] SAM [102,103] und NAD [104][105][106][107][108] zu erzeugen (4.2-4.4; siehe auch Lit.…”

“…[86,87] Verschiedene Fluorophor-Sonden. [83,100,[104][105][106][107][108] NCB10 (Herz-Kreislauf-Erkrankungen, S-Adenosyl-L-homocysteinhydrolase) [141] Pyridoxalphosphat (PLP) Alkin-, Azid-und elektrophile Sonden, [21,25,35] fluoreszierende Chemosensor-Analoga [111][112][113] S-Adenosyl-L-methionin (SAM)Verschiedene Alkin-, [75] Azid- [72] und Photoaffinitäts-funktionalisierte Sonden [76] . Verschiedene Fluorophor-Sonden.…”