Zellpermeable Nanobodys ermöglichen Zwei‐Farben‐Superauflösungsmikroskopie in lebenden, nicht transfizierten Zellen

Abstract

Die Superauflösungsmikroskopie in lebenden Zellen ist durch die Verfügbarkeit kleiner Molekülsonden, die nur gegen wenige Targets und genetisch kodierte Tags existieren, eingeschränkt. Hier erweitern wir die Anwendbarkeit von STED mithilfe zellgängiger, stark fluoreszierender Nanobodys für das intrazelluläre Targeting. Um helle Fluoreszenzsignale bei niedriger Konzentration zu gewährleisten, nutzten wir intramolekulare Photostabilisierung, indem wir einen Fluorophor zusammen mit dem Photostabilisator Trolox mittels EPL an den Nanobodys ligierten. Zudem sind diese semi‐synthetischen Nanobodys mit einem spaltbaren, zellpenetrierenden Peptid für ein effizientes Eindringen in die Zelle ausgestattet. Dadurch können wir sowohl GFP und mCherry als auch zwei endogene Zielmoleküle, die nuklearen Lamine und das DNA‐Replikations‐ und Reparaturprotein PCNA, mittels superauflösender Bildgebung visualisieren. Wir haben zudem die Zellteilung und DNA‐Replikation mittels konfokaler oder STED‐Mikroskopie überwacht und damit den Nutzen dieser Werkzeuge für die Funktionsanalyse demonstriert.