Verfahren zum qualitativen Nachweis von Verotoxin-produzierendenEscherichia coli (VTEC) in Lebensmitteln und Fäzes

Abstract

ZusammenfassungFiir den Nachweis von VTEC in Lebensmitteln und F~izes wird ein Verfahren vorgestellt, das nach optimierter Anreicherung sowohl einen sensitiven VT-Screening-Schritt (alternativ ELISA oder PCR) als auch eine Methode zur gezielten Isolierung der VTEC beinhaltet. Die VT-positiven Isolate miissen dann nach biochemischer Best~itigung als E. coli und Serologie-molekularbiologisch auf zus~itzliche Virulenzmarker untersucht werden. Als geeignetes Anreicherungsmedium fiir Lebensmittel und F~izes stellte sich mTSB heraus. Das Sch/.itteln der Kulturen und der Mitomycin-C-Zusatz erh6hten die Nachweisempfindlichkeit fiir VT erheblich. Fiir das VT-Screening aus der 18h-Kultur sind der selbstentwickelte VT-Rezeptor-ELISA,,BgVV,,, der kommerzielle Premier-EHEC und die PCR (MKI/MK2) alternativ einsetzbar. SummaryA procedure for the detection of VTEC in foods and faeces A procedure for the detection of VTEC in foods and faeces is presented. This procedure includes an optimized enrichment, sensitive VT-screening tests by using ELISA or PCR and a specific isolation of VTEC/EHEC. The VT-positive isolates must be confirmed as E. coti by means of biochemical methods. Furthermore serotype and other virulence factors have to be detected.A suitable nutrient medium for VTEC-enrichment in foods and faeces is mTSB. Shaking and addition of Mitomycin C to the nutrient medium increase the sensitivity of VT-detection considerably. The self-developed VT-receptor-ELISA,,BgVV,,, the commercial available Premier-EHEC and PCR (MKI/MK2) are alternatively applicable for VTscreening after enrichment. In case of VT-positive samples a specific serovare-independent isolation by using of VT-Colony-Immunoblot is following. The isolation rate is more than 90 %. A combination of this method with the immunomagnetic separation (IMS) is recommended in case of EHTEC O157. The detection limit of the whole procedure is approximately 10 CfU/25 ml or 25 g of foods. Reproducible results are also found after deepfreezing or storing samples in refrigerator before testing (milk > 8 d at -20 °C, minced meat > 14 d at-20 °C, feacaI samples > 8 d at +4 °C). Soft cheeses and raw sausages have to be examined immediately without storage.

Rapid laboratory identification and characterization of verocytotoxigenic (Shiga toxin producing) Escherichia coli (VTEC/STEC)

“…While first reported at a congress, it is based on more formally published earlier studies (Gallien et al. 1996, 1998; Timm et al. 1996, 1998).…”

“…An important component of this rapid commercially available technique is a special double membrane technique (Timm et al. 1996, 1998).…”

Diagnosis of Shiga Toxin-Producing Escherichia coli Infections/Die Diagnostik von Shiga Toxin-produzierenden Escherichia coli-Infektionen

“…The Shiga Toxin (Verotoxin) Colony Immunoblot [51] is a novel, labour-saving and rapid commercial method for the isolation of single STEC colonies from stool which reacted positively in screening methods. The base for the Stx colony immunoblot is a special double membrane agar technique [52,53]. This technique enables the immunological Stx detection on a nitrocellulose (NC) membrane and the isolation of the Stx positive colonies from a cellulose acetate (CA) membrane for further characterization.…”

Zur Verbesserung der gegenwärtigen bakteriologischen Diagnostik von enterohämorrhagischen Escherichia coli (EHEC)

“…Die Re-Isolierung der eingesetzten Stämme aus den künstlich kontaminierten Stuhlproben erfolgte nach dem von Timm et al [36] [25,27,28]), wurden verschiedene diagnostische Verfahren auf der Grundlage ihrer Shigatoxinbildungsfähigkeit entwickelt. Dabei standen Methoden der PCR und Gensonden zum Nachweis der entsprechenden Determinanten [11,14,33] einerseits und serologisch-immunologische Methoden zum Nachweis der Toxine andererseits [26,28,32,35,36,41,42] im Blickpunkt.…”

“…Es wurde daher ein Stufenplan der EHEC-Diagnostik vom gemeinsamen Arbeitskreis "EHEC" des Robert Koch-Instituts (RKI) und des Bundesinstituts für gesundheitlichen Verbraucherschutz und Veterinärmedizin (BgVV) mit Unterstützung der Fachgruppe "Gastrointestinale Infektionen" der Deutschen Gesellschaft für Hygiene und Mikrobiologie (DGHM) entwickelt [11,34], der eine solche Trennung vorsieht und dabei auch die Gesichtspunkte einer Meldepflicht für EHEC (frühzeitiges Einschalten der Gesundheitsämter) sowie die methodischen Möglichkeiten der Primärdiagnostik berücksichtigt. Parallel war dazu durch das veterinärmedizinische Nationale Referenzlabor E. coli (NRL) für die entsprechenden Laboratorien der Lebensmittelüberwachung und der Veterinärmedizin neben der PCR das ELISA-Screening mit einer anschließenden Isolierung durch den VT-Kolonie-Immunoblot für die Diagnostik Shigatoxin produzierender Bakterien als gleichwertig empfohlen worden [30,32,35,36]. Aus der Sicht des NRZ Salmonellen und andere Enteritiserre-ger war zunächst der PCR der Vorrang gegeben worden [11,14], weil für die Meldungen an das zuständige Gesundheitsamt eine sichere Verdachtsdiagnose vorliegen sollte.…”