Vascularization of connective tissue in Organ-on-Chip

Abstract

Οι καλλιέργειες κυττάρων in vitro έχουν αποδειχθεί πολύτιμο εργαλείο για την προώθηση της κατανόησης της λειτουργείας και των βιολογικών μηχανισμών που διέπουν την κυτταρική συμπεριφορά in vivo και να αποκρυπτογραφήσουν τους μηχανισμούς που ενέχονται στην νόσο. Για παράδειγμα, οι διδιαστατες (2D) κυτταρικές καλλιέργειες έχουν χρησιμοποιηθεί στην ανακάλυψη φαρμάκων για τη μελέτη των κυτταρικών αποκρίσεων σε βιοφυσικές και βιοχημικές διεγέρσεις για πάνω από έναν αιώνα. Ωστόσο, παρά το γεγονός ότι είναι καλά αποδεκτά και έχουν συμβάλει σημαντικά στην προώθηση της κατανόησής μας για την κυτταρική βιολογία, αυξανόμενες ενδείξεις δείχνουν ότι η κυτταρική συμπεριφορά σε συστήματα 2D αποκλίνει σημαντικά από το in vivo και προβλέπουν τη φυσική κυτταρική απόκριση μόνο υπό συγκεκριμένες συνθήκες. Λόγω αυτών των περιορισμών, έχει γίνει προσπάθεια διερεύνησης εναλλακτικών τρόπων καλλιέργειας και παρατήρησης των βιολογικών ιστών. Ωστόσο, η αναδημιουργία των συνθηκών για την μίμηση βιολογικών λειτουργιών σε επίπεδο οργάνου ή η αναπαραγωγή της φυσικής και παθοφυσιολογικής απόκρισης in vitro είναι δύσκολη, εν μέρει λόγω της περιορισμένης κατανόησης της πολυπλοκότητας του βιολογικού μικροπεριβάλλοντος και της συνολικής μικροαρχιτεκτονικής του ιστού, αλλά και λόγω της περιορισμένης ικανότητάς μας να αναπαράγουμε το συγκεκριμένο όργανο-ιστό ex vivo. Ως αποτέλεσμα, χρησιμοποιούνται συνήθως τα ζωικά μοντέλα για την ανάλυση συστημικού επιπέδου σε μελέτες για τους μηχανισμούς της ανθρώπινης νόσου. Τα ζωικά μοντέλα έχουν συμβάλει σε σημαντικά ευρήματα και ανακαλύψεις στην κατανόηση των υποκείμενων μηχανισμών διαφόρων ασθενειών, ωστόσο η προγνωστική τους αξία είναι συχνά χαμηλή, οδηγώντας σε μεταφραστική στον άνθρωπο αποτυχία, εκτός από το ότι είναι κοστοβόρα και εγείρουν πολλά ζητήματα βιοηθικής Είναι πλέον γνωστό ότι περισσότερο από το 90% των φαρμάκων που εισέρχονται σε κλινικές δοκιμές αποτυγχάνουν, παρά τα θετικά αποτελέσματα σε προκλινικές δοκιμές σε πειραματοζώα. Η αποτυχία στην ανάπτυξη νέων θεραπευτικών έχει δείξει επανειλημμένα ότι τα ζωικά μοντέλα δεν μιμούνται με ακρίβεια τις ανθρώπινες φυσιολογικές αποκρίσεις ή δεν προβλέπουν με ακρίβεια την αποτελεσματικότητα και την τοξικότητα του φαρμάκου στον άνθρωπο λόγω των εγγενών βιολογικών διαφορών που υπάρχουν μεταξύ των διαφόρων ειδών σε γενετικό και ανατομικό επίπεδο. Πρόσφατες μελέτες έδειξαν ότι η τρισδιάστατη βιομιμητική καλλιέργεια που προσομοιώνει το φυσικό κυτταρικό μικροπεριβάλλον μπορεί να πετύχει τα κύτταρα να συμπεριφέρονται φυσιολογικά και ως εκ τούτου να χρησιμοποιηθεί για τη βελτίωση της προκλινικής αποτελεσματικότητας και τοξικότητας των φαρμάκων καθώς και της δοκιμής αποτελεσματικότητας in vitro, προσφέροντας μια εναλλακτική λύση στη χρήση ζωικών μοντέλων. Στοιχεία της φυσικής αρχιτεκτονικής μικροπεριβάλλοντος, συμπεριλαμβανομένων της κυτταρικής και διακυτταρικης σύνθεσης και τοπογραφίας του ιστού, η τριών διαστατική δομική γεωμετρία του καθώς και οι μηχανικές δυνάμεις όπως η διακυτταρικη τάση η κυτταρικη διάταση αντιπροσωπεύουν βασικά συστατικά για την προσομοίωση των φυσιολογικών και παθολογικών λειτουργιών των οργάνων. Τα τρισδιάστατα συστήματα κυτταροκαλλιέργειας που επιτρέπουν την προσομοίωση της in vivo πολυπλοκότητας θα μπορούσαν να γεφυρώσουν το χάσμα μεταξύ πειραματοζώων και ανθρώπων στις προκλινικές μελέτες. Μεταξύ όλων των μοντέλων in vitro οι 3D κυτταροκαλλιέργειας, που είναι γνωστές ως Organ-on-a-Chip κέρδισαν πρόσφατα δυναμική επειδή κατάφεραν να προσομοιάσουν τα επίπεδα της κυτταρικής διαφοροποίησης και της οργάνωσης των ιστών που δεν επιτυγχάνεται σε συμβατικά συστήματα δύο διαστάσεων (2D) ή τρισδιάστατων (3D) καλλιεργειών. Ο Δρ Dongeun Dan Huh, ο οποίος θεωρείται ο εφευρέτης της τεχνολογίας Organ-on-a-Chip, ανέφερε στη περίφημη δημοσίευση του: «Η ανασύσταση των λειτουργιών των πνευμόνων σε επίπεδο οργάνου σε ένα τσιπ» ότι η αναπαραγωγή της αρχιτεκτονικής των οργάνων είναι απαραίτητη για την προσομοίωση των λειτουργιών των ιστών. Στοιχεία όπως παροχή οξυγόνου, χωροχρονικές βιολογικές αποκρίσεις, τα θρεπτικά συστατικά, τα κυτταρικά συστατικά του τοπικού μικροπεριβάλλοντος, η γεωμετρία της διεπαφής μεταξύ των διαφόρων ιστών (π.χ. μεταξύ επιθηλίου και αγγειακού ενδοθηλίου) και οι μηχανικές δυνάμεις που δρουν στα κύτταρα (π.χ. μηχανικές ιστιδικης διάτασης, ροή αέρα στο κυψελιδικό επιθήλιο και ροή υγρού στο ενδοθήλιο) παίζουν καθοριστικό ρόλο στη συμπεριφορά των κυττάρων και στην ικανότητα να εκφράζουν τις φυσικές τους λειτουργίες. Επομένως, απαιτείται πρόοδος στα βιοϋλικά και την μηχανική των ιστών για την ακριβέστερη προσομοίωση των ανθρωπίνων ιστών σε ένα ελεγχόμενο μικροπεριβάλλον συγκεκριμένων πτυχών της ανθρώπινης φυσιολογίας και για την προώθηση του τομέα της μηχανικής των ανθρωπίνων ιστών και της αναγεννητικής ιατρικής. Η προσομοίωση υγιών ή ασθενών πρωτογενών κυψελιδικών φυσιολογικών ανθρώπινων κυττάρων in vitro είναι πολύ περίπλοκη και υπήρξε ιστορικά ανεπιτυχής διότι τα πρωτογενή ανθρώπινα κυψελιδικά κύτταρα είναι πολύ ευαίσθητα στο μικροπεριβάλλον και δεν έχουμε γνώση σχετικά με τις συγκεκριμένες οδούς σηματοδότησης που συμβάλλουν κυρίως στην κυτταρική επιβίωση, διαφοροποίηση και ωρίμανση στο κυψελιδικό μικροπεριβάλλον. Μια κατάσταση που έχει εκ των πραγμάτων περιορίσει έντονα την ικανότητά μας να κατασκευάσουμε in vitro μοντέλα κυψελίδων στα οποία τα πρωτογενή ανθρώπινα κυψελιδικά κύτταρα διατηρούν φαινοτύπους διαφοροποιημένους για ενήλικες, κυτταρικές λειτουργίες και συνθέτουν πρωτεΐνη επιφανειοδραστικού παράγοντα C. Κατά συνέπεια, οι παραδοσιακές in vitro 2D και 3D κυψελιδικές μέθοδοι καλλιέργειας απέτυχαν πλήρως να αναπαραγάγουν τη δομική και λειτουργική φυσιογνωμία του φυσικού κυψελιδικού ιστού και κατέληξαν σε ένα υπερ-απλουστευμένο μοντέλο του ανθρώπινου πνεύμονα, όπου τα περισσότερα από τα βασικά στοιχεία του φυσικού περιβάλλοντος είναι απόντα. Στις προσπάθειές μας να αντιμετωπίσουμε αυτόν τον περιορισμό, αναπτύξαμε μια πιο ολοκληρωμένη πλατφόρμα για την καλλιέργεια τρισδιάστατων μοντέλων ανθρώπινου επιθήλιου συνδυάζοντας τα πλεονεκτήματα που προσφέρει η τεχνολογία Organ-on-a-Chip με πλεονεκτήματα που προσφέρονται από οργανοτυπικές καλλιέργειες, οι οποίες είναι τρισδιάστατα συστήματα καλλιέργειας όπου τα κύτταρα αναπτύσσονται χρησιμοποιώντας ικριώματα κατασκευασμένα από φυσική εξωκυτταρική μήτρα (ECM) για τη διατήρηση μέρους της αρχιτεκτονικής στρώματος-επιθηλίου και των περισσότερων κυτταρικών αλληλεπιδράσεων εντός του καλλιεργημένου οργάνου. Συγκεκριμένα, αξιοποιώντας τεχνολογίες μικροκατασκευής που προέρχονται από τη βιομηχανία των μικροτσίπ, κατασκευάσαμε ένα μικρορευστό τσιπ που ενσωματώνει μια υδρογέλη με το φυσικό συστατικό του τσιπ. Αναπαράγει τα περισσότερα από τα δομικά στοιχεία της διατομής του κυψελιδικού τοιχώματος και προσομοιώνει τις μηχανικές δυνάμεις που συνήθως δρουν στα κυψελιδικά μικροπεριβάλλοντα όπως μηχανική έκταση. Ένα in vitro μοντέλο του ανθρώπινου αναπνευστικού επιθηλίου που παρέχει επαρκή μίμηση του μικροπεριβάλλοντος του πνεύμονα θα μπορούσε να διευκολύνει την ανακάλυψη φαρμάκων και να δώσει νέα εικόνα σχετικά με τους μηχανισμούς της πνευμονικής νόσου της χρόνιας αποφρακτικής πνευμονικής νόσου (ΧΑΠ), του άσθματος και της ιδιοπαθούς πνευμονικής ίνωσης (IPF) ή οξύς τραυματισμός όπως πνευμονική βλάβη που σχετίζεται με αναπνευστήρα (VALI) για την οποία δεν υπάρχουν διαθέσιμα ολοκληρωμένα μοντέλα. Τα περισσότερα από τα υπάρχοντα μοντέλα κυψελίδων δεν διαθέτουν τη βιολογική αρχιτεκτονική, την κυτταρική πολυπλοκότητα και τα μηχανικά ερεθίσματα του μικροπεριβάλλοντος που είναι απαραίτητα για την προσομοίωση των μηχανισμών της νόσου. Στην ερευνητική μας εργασία περιγράφουμε την ανάπτυξη ενός τρισδιάστατου ανθρώπινου αναπνευστικού «Alveolus-Chip» που ενσωματώνει ένα διάμεσο διαμέρισμα περιέχον ινοβλάστες πνευμόνων επενδυμένους με επιθηκθακα πνευμονικά κύτταρα και μικροαγγειακά πνευμονικά ενδοθηλιακά κύτταρα. Το διάμεσο διαμέρισμα παρέχει δομική και λειτουργική υποστήριξη στο κυψελιδικό επιθήλιο και προάγει την ωρίμανση των ειδικών για τον ιστό βιοδείκτες. Δείχνουμε για πρώτη φορά ότι πρωτογενή ανθρώπινα κυψελιδικά κύτταρα συν-καλλιεργούμενα με πρωτογενείς ανθρώπινους πνευμονικούς ινοβλάστες και μικροαγγειακά ενδοθηλιακά κύτταρα, εκτεθειμένα σε κινήσεις αέρα και αναπνοής, εκφράζουν συγκεκριμένους βιοδείκτες του ιστού και εκκρίνουν τις σχετικές διαλυτές επιφανειοδραστικές πρωτεΐνες. Τα μοντέλα συν-καλλιέργειας που χρησιμοποιούν ανθρώπινα πρωτογενή επιθηλιακά, μεσεγχυματικά και ενδοθηλιακά κύτταρα είναι ιδιαίτερα σημαντικά στην προσπάθεια της ανακάλυψης φαρμάκων και της δοκιμής φαρμάκων, επειδή ο μεταβολισμός φαρμάκων είναι μια ειδική για κάθε είδος διαδικασία. Το μοντέλο Alveolus-Chip χρησιμοποιήθηκε για να προσομοιώσει μερικές από τις βασικές πτυχές της οξείας και χρόνιας πνευμονικής βλάβης που προκαλείται από οξειδωτικό στρες, συμπεριλαμβανομένης της απώλειας διεπαφής αέρα-υγρού, απελευθέρωση προφλεγμονωδών κυτοκινών και σχηματισμός θρόμβων αιμοπεταλίων. Δείχνουμε ότι η αγγειακή χορήγηση θεραπευτικών ενώσεων με στόχευση της οδού Nrf2 προστατεύει το Alveolus-Chip από οξείες βλάβες οξειδωτικού στρες και μειώνει τη φλεγμονώδη απόκριση. Η προσέγγισή μας βασίστηκε στην καλύτερη μίμηση του φυσικού μικροπεριβάλλοντος των ανθρώπινων πνευμονικών ιστών που υποστήριξε τη διαφοροποίηση των κυψελιδικών κυττάρων και εν μέρει τις λειτουργίες του κυψελίδας. Το μοντέλο Alveolus-Chip, θα μπορούσε να συμβάλει στη βελτίωση της λειτουργικότητας και άλλων μοντέλων οργάνων, να βοηθήσει στην προσομοίωση της συστημικής απόκρισης του ανθρώπινου σώματος, συνδυάζοντας και συνδέοντας πολλαπλά μοντέλα τσιπ οργάνων μέσω ενός ολοκληρωμένου μικρορευστικού κυκλοφορικού συστήματος που θα χρησίμευε στο μέλλον στην αντικατάσταση των πειραματόζωων.