Use of duplex polymerase chain reaction (duplex-PCR) technique to identify bovine and water buffalo milk used in making mozzarella cheese

Abstract

Molecular biology techniques have been used for species identification in food of animal origin in relatively recent years. A polymerase chain reaction (PCR) based method, the multiplex PCR, was recently applied to species identification in meat and meat products. It allows co-amplification of separate regions of a single gene or specific fragments, each typical of a different animal species in a single PCR reaction, using different pairs of primers in the same reaction mix. In the present paper, the duplex-PCR technique is proposed to identify bovine and water buffalo DNA in a single PCR assay in milk and mozzarella cheese (a typical Italian cheese, originally made from pure water buffalo milk). Because of its lower cost, undeclared bovine milk is added to water buffalo milk for making different kinds of mozzarella cheese. The results of this experiment indicate the applicability of this method, which showed an absolute specificity for the two species and a high sensitivity even down to low DNA concentrations (1 pg). In bovine and water buffalo mixtures of both milk and mozzarella cheese, the minimum concentration tested was 1% of bovine in water buffalo milk and water buffalo in bovine milk. The importance of the somatic cell content in raw milk is also discussed with special reference to the evaluation of mixtures (milk or cheese) of the two species.

Extração de DNA e avaliação da composição espécie-específica de queijos

“…Foram testadas três técnicas de extração de DNA: extração com o kit QIAMP DNA Stool mini kit (da Qiagem), conforme instruções do fabricante; pela técnica descrita por Sambrook et al(1989); e pela técnica de Boom et al (1990).…”

“…Em relação à carne, este método é eficaz tanto em matéria crua quanto em produtos fermentados, cozidos ou autoclavados (Pascoal et al, 2005;Lopparelli et al, 2007;Corona et al, 2007). Porém, em relação a produtos lácteos, a extração de DNA se torna uma etapa crítica dessa metodologia, pois este é obtido das poucas células somáticas originárias da parede do úbere presentes no leite de vacas saudáveis (Branciari et al, 2000;Herman, 2001;Rea et al, 2001;Zhang et al, 2007). O aquecimento e a manipulação do leite ou queijo também prejudicam a obtenção de fragmentos de DNA em quantidade e com qualidade (Zhang et al, 2007).…”

Mozzarella de búfala: avaliação da reação em cadeia pela polimerase (PCR) para detectar fraude devido à adição de leite de vaca ao de búfala

“…Esse recurso é eficiente e empregado com sucesso, no entanto, exige elevada habilidade e sofisticação laboratorial (REA et al, 2001). …”

“…Entre eles a reação em cadeia pela polimerase (PCR) destaca-se pela facilidade e rapidez de execução (REA et al, 2001;BOTTERO et al, 2002). …”

“…A identificação da origem animal de queijos tipo mozzarella de búfala foi realizada com base na detecção diferencial entre DNAmt bovino e bubalino por Rea et al (2001) Pela avaliação da PCR descrita por Rea et al (2001), é possível detectar queijo tipo mussarela de búfala adulterado com até 1 % de leite de origem bovina.…”