Two Successive Reactions on a DNA Template: A Strategy for Improving Background Fluorescence and Specificity in Nucleic Acid Detection

Franzini, Raphael M.; Kool, Eric T.

doi:10.1002/chem.201002426

Cited by 45 publications

(40 citation statements)

References 47 publications

Supporting

Mentioning

Contrasting

Unclassified

Order By: Relevance

“…The QUAL reaction exhibits moderate reaction rates that may be increased by using stronger nucleophiles such as phosphorotrithioates 45 or by fine-tuning the leaving group ability. Furthermore, by employing doubly quenched QSTAR-DNA probe designs, 35 the background signal can likely be reduced, which is expected to increase the limit of detection of FACTR yet further.…”

Section: Discussionmentioning

confidence: 99%

Fluorogenic Templated Reaction Cascades for RNA Detection

Velema

Kool

2017

J. Am. Chem. Soc.

Self Cite

View full text Add to dashboard Cite

Nucleic acids detection is essential to the study of biological processes and to diagnosis of pathological states. Although PCR is highly effective in vitro, methods that can function without prior sample preparation, thermal cycling, or enzymes are of interest due to their simplicity. Most current non-PCR detection methods rely on linear signal amplification, which hinders the detection of small amounts of genetic material. To address this limitation, we tested a new strategy for attaining higher-order signal amplification, in which a target sequence templates a chemical ligation, and the product of this reaction is in turn detected with a second templated reaction. The method is nonenzymatic, isothermal, and fluorogenic, allowing the direct detection of nucleic acids in complex matrices. Using this approach, as little as 500 attomoles (10 pM) could be detected with single nucleotide resolution. In a test of selectivity, single nucleotide substitutions and deletions could successfully be detected, including a deletion that is associated with tetracycline resistance in Helicobacter pylori. Compatibility with biological matrices was demonstrated by the direct detection of rRNA in bacterial lysate. Imaging and detection of target sequences on a solid support further illustrates the potential of the new approach for high-throughput analysis.

show abstract

Section: Discussionmentioning

confidence: 99%

Fluorogenic Templated Reaction Cascades for RNA Detection

Velema

Kool

2017

J. Am. Chem. Soc.

Self Cite

View full text Add to dashboard Cite

show abstract

“…[16] Die templatgesteuerte Wittig-Reaktion verläuft mit geringer Hintergrundgeschwindigkeit und ermçglicht das Auslesen der Fluoreszenzsignale binnen Minuten. Dieses System stellt nach unserem Kenntnisstand die erste DNAkontrollierte Reaktion dar, bei der eine katalytische Denovo-Synthese eines Fluoreszenzfarbstoffs gelingt.…”

unclassified

Konsekutive Signalverstärkung für die DNA‐Detektion basierend auf einer De‐novo‐Fluorophorsynthese und Wirt‐Gast‐Chemie

2012

View full text Add to dashboard Cite

Durch Nukleinsäuretemplate gesteuerte chemische Reaktionen erçffnen den Material-und Lebenswissenschaften faszinierende Mçglichkeiten. In kürzlich erschienenen Arbeiten wurde die Nukleinsäure-gesteuerte Chemie mit dem Ziel eingesetzt, replizierbare DNA-Nanoarchitekturen zu konstruieren, die Testung von Wirkstoffen zu erleichtern, DNA und RNA sogar in lebenden Zellen nachzuweisen und wirkstoffähnliche Moleküle freizusetzen. [1] Typischerweise werden bei diesen Umsetzungen stçchiometrische Mengen des DNA-Templats bençtigt. Jedoch würden viele Anwendungen von einer katalytischen Wirksamkeit des Templats profitieren. [1a] Intensive Anstrengungen galten der Entwicklung templatkatalysierter Reaktionen, durch die geringste Mengen an DNA oder RNA nachgewiesen werden kçnnen. [2][3][4] Dabei bewirkt ein Templatmolekül (= Analyt) die Bildung mehrerer Signalmoleküle. Der katalytische Umsatz am Templat stellt somit einen Mechanismus zur Verstärkung des detektierten Signals dar. Unter den üblicherweise ausgelesenen Werten wird Fluoreszenz mit Abstand am häufigsten genutzt. [3, 4] Methoden, bei denen die Gegenwart des Analyts einen Anstieg der Fluoreszenzintensität herbeiführt, gestatten Messungen in Echtzeit und bieten Ansätze, um RNA in lebenden Zellen bildgebend darzustellen und/oder DNA in einem PCR-freien Verfahren nachzuweisen.Die vorangegangenen Arbeiten auf diesem Gebiet konzentrierten sich auf DNA-gesteuerte Reaktionen zwischen markierten Oligonukleotiden, welche gelçschte Fluorophore oder Photosensibilisatoren trugen. [3, 4] Das Fluorophorsystem war dabei bereits vorhanden und die templatgesteuerte Reaktion diente einzig dem Zweck, die fluoreszenzlçschenden Gruppen voneinander zu entfernen. Detektionsverfahren, die auf gelçschten Fluorophoren beruhen, haben oft den Nachteil eines relativ hohen Hintergrundsignals, welches von unvollständiger Fluoreszenzlçschung bzw. der potentiellen hydrolytischen Spaltung estergebundener Chromophore herrührt. Kürzlich wurde eine Aldol-artige Chemie genutzt, um Cyaninfarbstoffe über eine DNA-gesteuerte Verknüpfungsreaktion zu generieren. [5] Hierbei wurde das Fluoreszenzsignal durch die Bildung eines Fluorophors erzeugt. Verknüpfungsreaktionen führen jedoch zu Produktinhibierung, was den katalytischen Umsatz am Templat und somit die Signalverstärkung verhindert. DNA-gesteuerte Spaltungsreaktionen zeichnen sich dagegen durch eine verminderte Produktinhibierung aus. So wurden templatgesteuerte Versionen der Staudinger-Reaktion zur Freisetzung von Stickstoff aus Azidgelçschten Fluorophoren oder a-Azidoether-verbrückten Lçschern genutzt. [4] Diese Reaktionen ermçglichten einen katalytischen Umsatz am Templat und hohe Fluoreszenzverstärkungen.Hier stellen wir nun einen neuen Ansatz vor, bei dem eine Olefinierungsreaktion, die über einen Gruppentransfer verläuft (und nicht etwa über eine Verknüpfungs-oder Spaltungsreaktion), zur De-novo-Synthese eines Fluorophors führt (Schema 1 a). In einem zweiten Schritt wird der neu gebildete Fluorophor durch ein Rezeptormolekül erkannt (Schema 1 b)....

show abstract

“…This concept was further elaborated in the design of 2‐STAR probes containing two quencher groups tethered again by azide‐based linkers to a DNA strand. In this case, the fluorescence was released only after a two‐step mechanism, which was demonstrated to be effective for decreasing auto‐fluorescence background, but also compromised sequence discrimination …”

Section: Uncaging Of Smart Probes For Nucleic Acid Imagingmentioning

confidence: 99%

“…In this case, the fluorescencew as released only after at wo-stepm echanism, which was demonstrated to be effective for decreasing auto-fluorescence background,b ut also compromised sequence discrimination. [38] Very recently,V elema and Kool developed another two-step mechanism based on aq uenched autoligation (QUAL) [36a, 39] / QSTAR-templated reactionc ascade. Upon recognition of atarget, the phosphorothioate hanging from aQUAL probe attacks the electrophilic carbon atom of ab utyl linker conveniently modified with aleaving group, yieldingthe ligatedoligonucleotides tethered by ab utyl linker.T he newly ligated strand spontaneously dissociates from the former target and acts as template itself, instructing the Staudinger reaction be- tween two QSTAR probes.…”

Section: Staudinger-triggered Release Of Fluorescencementioning

confidence: 99%

Nucleic Acid Templated Reactions for Chemical Biology

Pisa

Seitz

2017

ChemMedChem

View full text Add to dashboard Cite

Nucleic acid directed bioorthogonal reactions offer the fascinating opportunity to unveil and redirect a plethora of intracellular mechanisms. Nano‐ to picomolar amounts of specific RNA molecules serve as templates and catalyze the selective formation of molecules that 1) exert biological effects, or 2) provide measurable signals for RNA detection. Turnover of reactants on the template is a valuable asset when concentrations of RNA templates are low. The idea is to use RNA‐templated reactions to fully control the biodistribution of drugs and to push the detection limits of DNA or RNA analytes to extraordinary sensitivities. Herein we review recent and instructive examples of conditional synthesis or release of compounds for in cellulo protein interference and intracellular nucleic acid imaging.

show abstract

Two Successive Reactions on a DNA Template: A Strategy for Improving Background Fluorescence and Specificity in Nucleic Acid Detection

Cited by 45 publications

References 47 publications

Fluorogenic Templated Reaction Cascades for RNA Detection

Fluorogenic Templated Reaction Cascades for RNA Detection

Konsekutive Signalverstärkung für die DNA‐Detektion basierend auf einer De‐novo‐Fluorophorsynthese und Wirt‐Gast‐Chemie

Nucleic Acid Templated Reactions for Chemical Biology

Contact Info

Product

Resources

About