Transformação genética de milho com uma nova proteína - a Zeolina

Abstract

Aos colegas do curso de Genética e Melhoramento de Plantas, pelas discussões teóricas e ajuda prática nos trabalhos.A todos os amigos do Laboratório de Genética Bioquímica de Plantas pela convivência sempre agradável, em especial a Paula, Milca, Leila, Tiago, Salete e, principalmente a Daiana e a Gicka, sem os quais a realização do trabalho proposto não seria possível.Aos meus queridos amigos "piracicabanos", Pat, Felipe, Mateus e Renata, sempre presentes, apesar da distância.Aos meus novos e velhos amigos de Brasília, Marquim, Márcia, Letícia, Claudinha, Juliana, Rodrigo, Marcus, Leonardo, Jaqueline, por acreditarem em mim e na conclusão deste trabalho. RESUMO Transformação genética de milho com uma nova proteína -a ZeolinaA lisina é um dos aminoácidos essenciais e um dos fatores limitantes ao uso de cereais como o milho na alimentação pois, sem suplementação, não permite a obtenção de uma dieta balanceada. A fim de melhorar a qualidade nutricional dos cereais, várias tentativas têm sido feitas utilizando o melhoramento genético. Com o advento das técnicas de engenharia genética é possível, atualmente, utilizar a biotecnologia para aprofundar estes estudos, a fim de desvendar os complexos mecanismos que controlam o fluxo de aminoácidos nos grãos. O presente trabalho tem como objetivo principal testar uma nova estratégia que se baseia na expressão de uma proteína quimérica, a zeolina, sob controle de um promotor endosperma específico. A zeolina é uma combinação de 421 aminoácidos da faseolina do feijão com 89 aminoácidos da γ-zeína, inserida no genoma do milho sob controle de um promotor isolado da γ-kafirina de sorgo. Para que o objetivo do projeto fosse alcançado, o trabalho foi dividido nas seguintes etapas: i) Síntese da construção e clonagem nos vetores; ii) Transformação de embriões e calos de milho utilizando biobalística e Agrobacterium tumefaciens; iii) Cultura de tecidos para seleção e regeneração das plantas transformadas; iv) Verificação dos eventos de transformação através da análise do DNA, RNA e da proteína do transgene; v) Análises preliminares das plantas transformadas para o padrão das proteínas de reserva e perfil de aminoácidos dos grãos. A construção da zeolina foi amplificada por PCR com primers específicos e clonada nos vetores pCambia3301 e pTF102 sob controle do promotor da γ-kafirina. Os embriões e calos do milho híbrido HiII foram utilizados na transformação empregando-se a biobalística e Agrobacterium tumefaciens. No final do processo foram produzidas e multiplicadas oito plantas de milho transformadas com a zeolina, confirmadas por testes biológicos, PCR, sequenciamento e testes imunocromatográficos, representando seis eventos de transformação. A expressão gênica, verificada pela detecção do mRNA por PCR, foi constatada em seis eventos de transformação. Para detecção da proteína expressa pelo transgene foi utilizado anticorpo específico para faseolina, através do Western Blot. A banda relativa ao transgene foi detectada em três eventos de transformação. Nas análises preliminares ...

Caracterização das enzimas chaves para o controle do metabolismo de lisina em milho (Zea mays L.) geneticamente modificado

“…Esta diferença deve se referir aos aminoácidos incorporados na proteína zeolina. Com a expressão da zeolina, a demanda por aminoácidos como a lisina é maior, assim mais aminoácidos são produzidos, mas estes são direcionados à síntese da zeolina e não ficam disponíveis na forma de aminoácidos solúveis totais, o que coincide com os resultados que Ambrozevicius (2010) obteve. Desta forma a zeolina funcionaria como um dreno, em que os aminoácidos que estão em excesso são incorporados a ela e as rotas metabólicas são capazes de se ajustar a fim de atender o requerimento por aminoácidos.…”

“…A fim de melhorar a qualidade nutricional dos cereais, várias tentativas têm sido realizadas baseadas em resultados obtidos sobre as rotas de metabolismo da lisina em plantas e o acúmulo de proteínas de reserva no endosperma. Ambrozevicius (2010) com o objetivo de produzir plantas de milho transgênicas com alto teor de lisina utilizou a estratégia de expressão de proteínas de reserva de outras espécies vegetais ricas em lisina, ou seja, através da expressão de uma proteína heteróloga: a zeolina. O presente trabalho teve como objetivo estudar os 6 eventos transformados expressando a zeolina na geração F3, caracterizando as proteínas de reserva, o perfil de aminoácidos e as enzimas envolvidas no metabolismo de lisina em milho geneticamente modificado, para compreender quais as possíveis alterações bioquímicas podem ter sido geradas pela transformação, e que podem ter levado ao incremento dos aminoácidos essenciais neste material transgênico.…”

“…In order to improve the nutritional quality of cereals, several attempts have been made based on the results about routes of metabolism of lysine in plants and accumulation of storage proteins in endosperm. Ambrozevicius (2010) with the objective of producing transgenic corn plants with high content of lysine used a strategy of expression of storage proteins from other plant species which are rich in lysine, it means, through the expression of a heterologous protein: zeolin. This work aimed to study the 6 events processed expressing zeolina in F3 generation, featuring the storage proteins, the profile of amino acids and enzymes involved in the metabolism of lysine in genetically modified corn, in order to understand the possible biochemical changes which may have been generated by the transformation, and that may have led to the increase of essential amino acids in transgenic material The storage protein profile of transformed events exhibited reduction in the proportion of zein II and glutelins compared to control HiII, and yet very discrete increments of globulin, but not for all events processed.…”