Transfer of optogenetic vectors into the brain of neonatal animals to study neuron functions during subsequent periods of development

Abstract

Optogenetics, that is, the control of cell activity using light-sensitive ion channels opsins with light of a specific avelength, is increasingly being used to study activities and functions of neurons. Expression of opsins in the cell membrane, followed by the acquisition by the cell of the sensitivity to light is achieved by means of viral vectors, often created on the basis of lentiviral or adeno-associated (AAV) viruses bearing the nucleotide sequence encoding the photo-channel proteins. Inclusion of the cell-spe cific p omoter of interest into the transgene-expression cassette allows opsin to be produced only in the target cells. The aim of this work was to briefly desc ibe the optogenetic method, as well as to analyze the possibility to use administration of viral vectors into the brain of neonatal animals to study the function of neurons in vivo during subsequent periods of development. In this analysis, 3-day-old rat pups received intracerebroventricular injections of optovector (pAAV-CAMKIIa-ChR2 h134 -YFP), coding for a photo channel, which activates neurons, and the yellow fluo escent marker protein under the CAMKIIa promoter specific or glutamatergic neurons under cold anesthesia. The peak expression of the transferred gene is usually achieved at week 3-5 after the transfer of the vector, which is what was also observed in our experiments. Stimulation of the hippocampal neu rons with blue light in the 20-day-old animals, to which opto-vector was transferred at the 3rd day of life, increased the discharge activity of these neurons. This light stimulation increased expression of the Управление активностью клетки светом определенной длины волны с помощью светочувствительных ионных каналов, опсинов, (оптогенетика) все более широко используется для исследования работы и функции нейронов. Внедрение в клеточную мембрану опсинов с последующим приобретением клеткой чувствитель но-сти к свету достигается с помощью вирусных векторов, создан ных чаще всего на основе лентиви ру сов или аденоаcсоциированных вирусов (AAV) и несущих нукле отидные последовательности, кодирующие белки фотокана лов. Введение в трансген-экспресси-рующую кассету специфического для интересующего типа клеток промотора позволяет целе направ ленно продуцировать опсин только в клетках-мишенях. Целью данной работы явились краткое описание оптогенетического подхода, а также анализ возможности его использования при введении вирусных векто-ров в мозг неонатальных животных для исследования функции нейронов in vivo в последующие периоды онтогенеза. В данной работе трехдневным крысятам под холодовым наркозом вводили в головной мозг оптовектор (pAAV-CAMKIIa-ChR2 h134 -YFP), кодирующий фотоканал, активирующий нейрон, и маркерный желтый флюоресцентный белок под контролем CAMKIIa промо-тора, специфичного для глутаматергических нейронов. Пик экспрессии внесенного гена, как правило, приходится на 3-5-ю неделю после введения вектора, что наблюдалось и в нашем случае. Фотостимуляция нейронов гиппокампа 20-дневных животных, которым на третий день жизни вводи...