Three recombinantly expressed apple tyrosinases suggest the amino acids responsible for mono- versus diphenolase activity in plant polyphenol oxidases

Abstract

Tyrosinases and catechol oxidases belong to the polyphenol oxidase (PPO) enzyme family, which is mainly responsible for the browning of fruits. Three cDNAs encoding PPO pro-enzymes have been cloned from leaves of Malus domestica (apple, MdPPO). The three pro-enzymes MdPPO1-3 were heterologously expressed in E. coli yielding substantial amounts of protein and have been characterized with regard to their optimum of activity resulting from SDS, acidic and proteolytic activation. Significant differences were found in the kinetic characterization of MdPPO1-3 when applying different mono- and diphenolic substrates. All three enzymes have been classified as tyrosinases, where MdPPO1 exhibits the highest activity with tyramine (kcat = 9.5 s−1) while MdPPO2 and MdPPO3 are also clearly active on this monophenolic substrate (kcat = 0.92 s−1 and kcat = 1.0 s−1, respectively). Based on the activity, sequence data and homology modelling it is proposed that the monophenolase and diphenolase activity of PPOs can be manipulated by the appropriate combination of two amino acids, which are located within the active site cleft and were therefore named “activity controllers”.

A catecholase fromLaccaria laccataa wild edible mushroom and its catalytic efficiency in organic media

“…1.10.3.1) catalyze oxidation of o ‐diphenols to o ‐quinones in the presence of molecular oxygen. Catecholases are metallo‐enzyme members of PPO family containing type III copper in their active site (Kampatsikas, et al, ).…”

Eine peptidvermittelte Selbstspaltungsreaktion initiiert die Tyrosinaseaktivierung

“…[3][4][5][6] Bislang wurde berichtet, dass PPOs von Pflanzen, Pilzen und Bakterien in vivo sowohl in ihrer pro-(oder latenten) Form als auch in ihrer aktiven Form vorliegen. [7][8][9][10] Konkret werden pflanzliche PPOs als Proenzyme (55-65 kDa) exprimiert, die aus einer enzymatisch aktiven (40-45 kDa) und einer C-terminalen Domäne (15)(16)(17)(18)(19) bestehen. [11,12] Die C-terminale Domäne spielt bei der Regulation der Enzymaktivitätind er Zelle eine wichtige Rolle,i ndem sie die katalytische Tasche des aktiven Zentrums abschirmt, und darüber hinaus fürd ie korrekte Faltung der aktiven Domäne notwendig ist.…”

“…[14] Es wird generell angenommen, dass pro-PPOs durch eine proteolytische Reaktion, auf die die Ablçsung der C-terminalen Domäne vom aktiven Protein folgt, aktiviert werden. [12,15] Apfel-und Champignon-Tyrosinasen kçnnen in vitro durch die Verwendung gebräuchlicher Proteasen aktiviert werden, [16,17] jedoch wurde in beiden Fällen die C-terminale Domäne nicht spezifisch abgespalten, sondern von den jeweiligen Proteasen (Trypsin und Proteinase K) vollständig verdaut. Aufgrund der fehlenden Kenntnis über den Aktivierungsprozess in vivo wird derzeit hauptsächlich das Detergens Natriumdodecylsulfat (SDS) zur In-vitro-Aktivierung von pro-PPOs verwendet.…”

“…Aufgrund der fehlenden Kenntnis über den Aktivierungsprozess in vivo wird derzeit hauptsächlich das Detergens Natriumdodecylsulfat (SDS) zur In-vitro-Aktivierung von pro-PPOs verwendet. [16][17][18] Die pro-Form von MdPPO1 wurde rekombinant in E. coli überexprimiert und aufgereinigt, um diese schließlich zu kristallisieren. [16,19] Während der anfänglichen Kristallisationsversuche mit pro-MdPPO1 wurden gut streuende Kristalle lediglich von der C-terminalen Domäne (C cleaved )e rhalten ( [20] Die angenommene Selbstspaltung von MdPPO1 wurde mittels SDS-PAGEvon pro-Enzymlçsungen, die 20 Tage lang bei 4 8 8Ci nkubiert worden waren, bestätigt.…”

“…B. durch SDS Zugabe oder hohe Salzkonzentrationen, siehe Hintergrundinformationen und Abbildung S3), volle enzymatische Aktivitäte rlangt. [16] Die Schnittstelle wurde durch hochauflçsende Elektrosprayionisations-Massenspektrometrie (ESI-MS) bestimmt, welche zeigte,d ass das Protein nicht nur an einer einzelnen Peptidbindung,s ondern innerhalb einer Sequenz von vier benachbarten Peptidbindungen (Ser 366-Ser 367-Ser 368-Lys369-Val 370, Abbildungen 2u nd S4) gespalten wird. Ein ähnliches Spaltungsverhalten wurde fürd ie aus der natürlichen Quelle gereinigte Walnuss-Tyrosinase beobachtet, die ebenfalls durch Peptidspaltungen innerhalb einer Sequenz von vier Aminosäuren (Pro 342-Thr 343-Pro 344-Arg 345-Lys346) aktiviert wird.…”