The peptidyl‐substituent within peptidyl‐tRNA increases the stability of tRNA—mRNA association

Holschuh, Karl; Schnerwitzki, Doris; Schmitt, Marion; Gassen, Hans Günter

doi:10.1016/0014-5793(82)80234-2

Cited by 3 publications

(4 citation statements)

References 12 publications

Supporting

Mentioning

Contrasting

Unclassified

Order By: Relevance

“…It has been repeatedly reported that EF-G-dependent translocation leads to a release of deacylated tRNA from the P site (13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)(20)(21). However, a closer inspection of the data reveals that many, if not all, of the reported data are in conflict with the predictions of the two-site model.…”

Section: Methodscontrasting

confidence: 52%

Testing an alternative model for the ribosomal peptide elongation cycle.

Rheinberger

Nierhaus

1983

Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.

View full text Add to dashboard Cite

A kinetic analysis of poly(U)-dependent poly(Phe) synthesis with ["4C] was observed after translocation when an aminoacyl-tRNA was bound to the A site. Thus, deacylated tRNA is not released from the P site but is translocated to the E site, which therefore must be located "upstream" adjacent to the P site. Furthermore, the trigger for the release of deacylated tRNA from the E site is the binding of aminoacyl-tRNA to the A site.In addition to the well-characterized aminoacyl-tRNA (A) and peptidyl-tRNA (P) sites, the Escherichia coli ribosome carries a third tRNA-binding site, the exit (E) site, which binds exclusively deacylated tRNA, depending on the codon present (1, 2). The detection of the third tRNA-binding site and the analysis of the binding capabilities of the tRNA-binding sites imply that the ribosome is not a rigid frame with two tRNA-binding sites, to which all different kinds of tRNA bind in the course of the ribosomal peptide elongation cycle. In contrast, the three tRNAbinding sites discriminate between various tRNAs depending on their charging status: Deacylated tRNA binds to all three sites, aminoacylated tRNA binds to the A and P sites, and peptidyl-tRNA binds to only one site, which can be either the A or the P site (exclusion principle; ref. 2).In this paper we probe an alternative model for the elongation cycle, characterized by the following main features: (i) two tRNAs are present on the ribosome at both the pre-and the post-translocational state; (ii) the E site is located adjacent to the P site towards the 5' end of mRNA ("upstream"); (iii) deacylated tRNA is released not from the P site but from the E site; (iv) the trigger for tRNA release from the E site is the binding of aminoacyl-tRNA to the A site. MATERIALS AND METHODSTightly coupled 70S ribosomes were isolated from E. coli K-12 cells (strain D10) as described (1). One A20 unit of 70S ribosomes was assumed to be equivalent to 24 pmol. More than 90% of the 70S ribosomes were engaged in the binding reaction as revealed by Ac-Phe-tRNAPhe binding experiments under saturation conditions. [3H]Phenylalanine (specific activity 84 Ci/ mmol; 1 Ci = 3.7 x 1010 Bq) was obtained from Amersham.The specific activity of phenylalanine was adjusted with nonlabeled phenylalanine according to the particular purpose of each experiment. Therefore, the actual specific activity is given in each experiment as cpm/pmol, which includes the instrumental efficiency. tRNAPhe was purchased from Boehringer Mannheim.[14C]tRNAPhe was labeled as described (2). The preparation of Phe-tRNAPhe and Ac-Phe-tRNA Phe and the isolation of elongation factor G (EF-G) were as described (5).Purification of Acylated tRNAPhe. Phe-tRNAPhe and Ac-PhetRNAPhe were freed from deacylated tRNA by benzoylated DEAE-cellulose chromatography (6). The preparations usually contained less than 10% deacylated tRNA.Poly(U)-Dependent Poly(Phe) Synthesis. The ionic conditions and compound concentrations were as described (5). In a total volume of 2 ml, 17 A260 units of 70S ribosomes were i...

show abstract

Section: Methodscontrasting

confidence: 52%

Testing an alternative model for the ribosomal peptide elongation cycle.

Rheinberger

Nierhaus

1983

Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.

View full text Add to dashboard Cite

show abstract

“…Translation is stopped by cooling on ice, and the ribosome complexes are further stabilized against dissociation by 50 mM magnesium acetate (18). Chloramphenicol at 50 M, assumed to also induce ribosome stalling (10,27), did not improve the selection properties (data not shown).…”

Section: Resultsmentioning

confidence: 99%

“…The translation was stopped by adding Mg(OAc) 2 to a final concentration of 50 mM and cooling on ice (18). The samples were diluted 4-fold with ice-cold washing buffer [50 mM Tris⅐HOAc, pH 7.5͞150 mM NaCl͞50 mM Mg(OAc) 2 ͞0.1% Tween 20] and centrifuged for 5 min at 4ЊC at 10,000 ϫ g to remove insoluble components.…”

Section: Methodsmentioning

confidence: 99%

In vitroselection and evolution of functional proteins by using ribosome display

Hanes

Plückthun

1997

Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.

1,001

623

View full text Add to dashboard Cite

We report here a system with which a correctly folded complete protein and its encoding mRNA both remain attached to the ribosome and can be enriched for the ligand-binding properties of the native protein. We have selected a single-chain fragment (scFv) of an antibody 10 8 -fold by five cycles of transcription, translation, antigen-affinity selection, and PCR. The selected scFv fragments all mutated in vitro by acquiring up to four unrelated amino acid exchanges over the five generations, but they remained fully compatible with antigen binding. Libraries of native folded proteins can now be screened and made to evolve in a cell-free system without any transformation or constraints imposed by the host cell.

show abstract

“…Как видно из данных эксперимента на рис. 3, сродство деацилированной TPHK phe к Р-сайту в четыре раза выше, чем у аналога пептидил-тРНК, что качественно согласуется с результатами в [5,6] и находится в противоречии с данными группы Гассена [4,28]. Привлекая наши более ранние данные для аминоацил-тРНК [25,26], мы можем теперь построить ряды относительного сродства всех трех форм тРНК к рибосомным сайтам при одних и тех же внешних условиях (15 мМ Μg 2 +, 20 мМ NH 4 + и 25 °С).…”

Section: результаты и обсуждениеunclassified

Quantitative study of interaction of deacylated tRNA with the P, A and E sites of Escherichia coli ribosomes

1985

View full text Add to dashboard Cite

Введение. Деадилированная тРНК, образующаяся на Р-сайте рибосом в результате транспептидации, является одной из трех функциональных форм тРНК, удаление которой в акте транслокации является одним из ключевых и в то же время малоизученных событий этого процесса. Ясно, что знание сродства деацилированной тРНК к активным сайтам рибосомы необходимо как для понимания энергетики транслокации, так и для изучения функций третьего, Ε-сайта, недавно обнаруженного в рибосомах из прокариот и специфичного к деацилированной тРНК [1]. На основе качественных данных Шраером и Нолем [2] был предложен следующий порядок относительного сродства функциональных форм тРНК к рибосомным сайтам: в ряду деацилированная тРНКиептидил-тРНК-аминоацил-тРНК сродство растет слева направо к Α-сайту и уменьшается к Р-сайту. В соответствии же с транслокационной гипотезой Ледера [3] сродство деацилированной тРНК, в противоположность этому порядку, к Р-сайту должно быть ниже (как продукта Р-сайта пептидилтрансферазы), чем у пептидил-тРНК, являющейся субстратом Р-сайта пептидилтрансферазы. Имеющиеся экспериментальные данные по этому вопросу также противоречивы, малочисленны и получены в разных экспериментальных системах и условиях (концентрации двух-и одновалентных катионов, температуры и т. д.). Так, данные Хольшуха и соавт. [4] о том, что сродство деацилированной тРНК ниже к Р-сайту, чем у аналога пептидил-тРНК-Ас-РЬе-тРНК р}1е-находятся в соответствии с гипотезой Ледера. По данным же Питере и Яруса [5] и Райнбергера и соавт. [6], наоборот, аналоги пептидил-тРНК имеют меньшее сродство к Рсайту, чем деацилированная тРНК. Зависимости же сродства обсуждаемых форм тРНК от этих условий неизвестны, что еще больше затрудняет сравнение результатов разных исследователей (например, константы ассоциации деацилированной тРНК с Р-сайтом колеблются от 10 6 М-1 у Хольшуха и соавт. [4] до 10 9 М-1-у Кантора и соавт. [7]). В настоящей работе измерены константы ассоциации деацилированной тРНК РЬе с Р-, А-и Е-сайтами 70S рибосом, а также определены зависимости этих констант на Р-сайте от концентрации ионов Mg 2J~ и температуры; определено относительное сродство аминоацил-, пептидил-и деацилированной тРНК к Р-, А-и Ε-сайтам; предлагается термодинамически обоснованная модель диссоциации деацилированной тРНК из рибосомы в процессе транслокации с использованием Е-сайта как выходного. Материалы и методы. Активные 30S-и 505-субчастицы, а также фракционированную поли(и) (М г = 30 ООО) получали, как в [8, 9]. Высокообогащенные препараты тРНК РЬе выделяли по следующей модифицированной процедуре. Тотальную тРНК, полученную по методу Зубея [10], пропускали через колонку с бензоилированной ДЭАЭцеллюлозой (БД-целлюлоза), используя последовательно два линейных градиента: NaCl (0,4-1,0 Μ) и этанола (0-50 %) (рис. 1, А). Эта предварительная стадия необходима, так как если не освободить тотальную тРНК от спиртовой фракции (рис. 1, А, пик //), она будет в дальнейшем неизбежно загрязнять Phe-TPHK Phe , поскольку обе выходят из колонки при одних и тех же концентрациях спирта (рис. 1, А, Б)....

show abstract

The peptidyl‐substituent within peptidyl‐tRNA increases the stability of tRNA—mRNA association

Cited by 3 publications

References 12 publications

Testing an alternative model for the ribosomal peptide elongation cycle.

Testing an alternative model for the ribosomal peptide elongation cycle.

In vitroselection and evolution of functional proteins by using ribosome display

Quantitative study of interaction of deacylated tRNA with the P, A and E sites of Escherichia coli ribosomes

Contact Info

Product

Resources

About