The checkpoint-dependent nuclear accumulation of Rho1p exchange factor Rgf1p is important for tolerance to chronic replication stress

Muñoz, Sofía; Manjón, Elvira; Garcia, Patrícia Salomão; Sunnerhagen, Per; Sánchez, Yolanda

doi:10.1091/mbc.e13-11-0689

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“…Rgf1 también es requerido para la reorganización de la actina en las células, durante el cambio de crecimiento monopolar a crecimiento bipolar en NETO (Garcia, et al, 2006). Además, esta proteína GEF actúa por encima del módulo de MAPKs en la ruta de integridad celular (Cruz, et al, 2013;Garcia, et al, 2009b) y se ha demostrado recientemente que se acumula en el núcleo de forma dependiente del checkpoint de replicación de ADN y es importante para la tolerancia al estrés replicativo (Munoz, et al, 2014).…”

Section: Rho1 En S Pombeunclassified

Interacciones de la GTPasa Rho1 con la ruta de MAPKs de integridad celular y la fosfatasa calcineurina en la levadura de fisión Schizosaccharomyces pombe

Viana¹

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Interacciones de la GTPasa Rho1 con la ruta de MAPKs de integridad celular y la fosfatasa calcineurina en la levadura de fisión Schizosaccharomyces pombe Memoria presentada por Raúl Alonso Viana para optar al Grado de Doctor en Bioquímica Salamanca, 2014 ii iii EL Dr. LUIS ROMÁN FERNÁNDEZ LAGO, PROFESOR TITULAR Y DIRECTOR DEL DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA Y GENÉTICA DE LA UNIVERSIDAD DE SALAMANCA CERTIFICA:Que la memoria titulada "Interacciones de la GTPasa Rho1 con la ruta de MAPKs de integridad celular y la fosfatasa calcineurina en la levadura de fisión Schizosaccharomyces pombe", presentada por el licenciado Raúl Alonso Viana para optar al grado de Doctor en Bioquímica, ha sido realizada bajo la dirección de los Dres. Mª del Pilar Pérez González y Pedro Miguel Coll Fresno, en el Instituto de Biología Funcional y Genómica, centro mixto de la Universidad de Salamanca (Departamento de Microbiología y Genética) y el Consejo Superior de Investigaciones Científicas.Y para autorizar su presentación y evaluación por el tribunal correspondiente, firma el presente certificado en Salamanca, a ___ de ________ de 201_. Fdo. Dr. Luis Román Fernández Lago iv v LA Dra. Mª del PILAR PÉREZ GONZÁLEZ, PROFESORA DE INVESTIGACIÓN DEL CSIC Y EL Dr. PEDRO MIGUEL COLL FRESNO, PROFESOR CONTRATADO DOCTOR PERMANENTE DEL DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA Y GENÉTICA DE LA UNIVERSIDAD DE SALAMANCA. CERTIFICAN:Que el licenciado Raúl Alonso Viana ha realizado el trabajo titulado "Interacciones de la GTPasa Rho1 con la ruta de MAPKs de integridad celular y la fosfatasa calcineurina en la levadura de fisión Schizosaccharomyces pombe" bajo su dirección, en el centro mixto Instituto de Biología Funcional y Genómica (CSIC) / Departamento de Microbiología y Genética (USAL).Y para autorizar su presentación y evaluación por el tribunal correspondiente, firmamos el presente certificado en Salamanca a ___ de ___________ de 2014. Fdo. Dra. Mª del Pilar Pérez González Fdo. Dr. Pedro Miguel Coll Fresno vi vii Agradecimientos "La amistad es un alma que habita en dos cuerpos; un corazón que habita en dos almas" Aristóteles viii AGRADECIMIENTOS ix AGRADECIMIENTOS xi pensar. Y por supuesto mis amigos Cacereños, Mario, José, María y Fajardo, no sé que habría hecho sin la tranquilidad que me da vuestra ciudad y sin vuestras conversaciones distendidas y frikis. Tampoco me quiero olvidar de mis amigos de Logroño, Carol, Germantxu (el gran artífice de esta portada), Sara, Germán, Diego y Ana. Y por último, me gustaría agradecerles todo lo que han hecho a mi familia. A mis padres, mi hermana (esa Gran Doctora (mira que me cuesta decirlo....);P), mis abuelos, primos y tíos. Sin vuestro apoyo incondicional, nada de esto hubiera sido posible. Me habéis hecho crecer y mejorar como persona desde siempre. Os debo todo lo que soy y seré.

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“…Curiosamente, el dominio DEP no está en Rgf3p, única de las tres proteínas que se localiza en el septo, pero no en los polos. Como veremos más adelante, al eliminar el dominio DEP de Rgf1p, la proteína mutada Rgf1p-DEPΔ-GFP se acumula en el núcleo, pero no desaparece de los polos (Munoz et al, 2014a).…”

Section: Gefs De La Gtpasa Rho1p En S Pombeunclassified

“…En S. pombe el estudio de las proteínas GEFs ha sido crucial para entender algunos de los procesos en los que participa Rho1p, por ejemplo: en la activación del crecimiento por el polo nuevo conocido como NETO (Garcia et al, 2006a), en la resistencia a estrés replicativo (Munoz et al, 2014a) y como veremos a lo largo de esta memoria, en la resistencia a estrés genotóxico.…”

Section: Gefs De La Gtpasa Rho1p En S Pombeunclassified

“…Como hemos visto en el apartado 6, además de los dominios Rho-GEF y PH, Rgf1p presenta también un dominio DEP (aa 424-497) cerca del extremo N´-terminal y un dominio CNH (aa 935-1239) en el extremo C´-terminal (http://smart.embl-heidelberg.de/smart/show_motifs.pl) (figura 22). Para determinar qué partes de Rgf1p contribuyen a su función se obtuvieron mutantes en el extremo N´-terminal, y en los dominios DEP, PH, y CNH, en los que se analizó la estabilidad de las proteínas mutadas, su localización, la sensibilidad a Csp y el % de células monopolares (Munoz et al, 2014a). Sorprendentemente, la proteína mutada DEP se acumula en el núcleo y en el SPB.…”

Section: Rgf1p Participa En La Tolerancia a Estrés Replicativo Crónicounclassified

“…exporte nuclear (NES1 y NES2) en el extremo C´-terminal (figura 22). La NLS que contiene 5 argininas y 1 lisina, 406 NKRRRRI 412 , se encuentra al lado del dominio DEP y es suficiente para dirigir la proteína al núcleo (Munoz et al, 2014a). Las NES son secuencias ricas en leucina y las proteínas que contienen estas secuencias son reconocidas y transportadas fuera del núcleo por el receptor de exporte nuclear tipo carioferina CRM1/Exportina 1 (Crm1p en S. pombe) (Xu et al, 2010).…”

Section: Rgf1p Participa En La Tolerancia a Estrés Replicativo Crónicounclassified

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Nueva función del Rho-GEF Rgf1p en el mantenimiento de la estabilidad genómica en Schizosaccharomyces pombe

Manjón¹

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A novel cell biological tool to explain mechanics and dynamics in fission yeast

Rasheed,

Mohy‐ud‐Din,

Anwar

et al. 2024

J Basic Microbiol

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The Rho guanosine triphosphatase hydrolase enzyme (GTPase) is required for the control of the actin cytoskeleton, but its activation in vivo condition is unknown. The study's goal was to find a new synthetic nanobody VHH (P‐36 tagged with mNeonGreen) that interacts strongly with the Rho GTPase. We present the first novel synthetic nanobody, VHH (P‐36 tagged with mNeonGreen), tested in fission yeast cells and found to have a particular interaction with Rho1GTPase. Plasmids were constructed by using of certain enzymes to digest the pDUAL‐pef1a vector plasmid to produce a protein that was encoded by cloned genes. A varied VHH library was created synthetically, then transformed into yeast cells, and positive clones were chosen using chemical agents. To investigate protein interactions and cellular reactions, several studies were carried out, such as live cell imaging, growth curve analysis, coimmunoprecipitation, structural analysis, and cell therapies. Prism and RStudio were used for the statistical analysis. The presence of VHH (P‐36) has no effect on the growth pattern making it an appropriate model for studying cytokinesis in vivo. According to a computational biological study, its affinity to interact with Rho1GTPase with all the complementarity‐determining region (CDR) regions found on VHH (P‐36) is extremely strong. We were able to track its subcellular target by localization using a fluorescent confocal microscope, ensuring the maintenance of cell polarity and morphology. Spheroplast analysis revealed a circular‐shaped cell with an even distribution of Rho1 tagged VHH (P‐36), indicating that the interaction occurs near the plasma membrane. The introduction of latrunculin‐A (Lat‐A) disrupted Rho GTPase localization, demonstrating the control over actin production, and the cell did not show evidence of mitotic phase commencement while Lat‐A was present. Finally, this important biological tool can aid in our understanding of the mechanics and dynamics of cytokinesis in relation to Rho1GTPase.

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The checkpoint-dependent nuclear accumulation of Rho1p exchange factor Rgf1p is important for tolerance to chronic replication stress

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