The Applicability of TaqMan-Based Quantitative Real-Time PCR Assays for Detecting and Enumerating Cryptosporidium spp. Oocysts in the Environment

Abstract

Quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR) assays to detect Cryptosporidium oocysts in clinical samples are increasingly being used to diagnose human cryptosporidiosis, but a parallel approach for detecting and identifying Cryptosporidium oocyst contamination in surface water sources has yet to be established for current drinking water quality monitoring practices. It has been proposed that Cryptosporidium qPCR-based assays could be used as viable alternatives to current microscopic-based detection methods to quantify levels of oocysts in drinking water sources; however, data on specificity, analytical sensitivity, and the ability to accurately quantify low levels of oocysts are limited. The purpose of this study was to provide a comprehensive evaluation of TaqMan-based qPCR assays, which were developed for either clinical or environmental investigations, for detecting Cryptosporidium oocyst contamination in water. Ten different qPCR assays, six previously published and four developed in this study were analyzed for specificity and analytical sensitivity. Specificity varied between all ten assays, and in one particular assay, which targeted the Cryptosporidium 18S rRNA gene, successfully detected all Cryptosporidium spp. tested, but also cross-amplified T. gondii, fungi, algae, and dinoflagellates. When evaluating the analytical sensitivity of these qPCR assays, results showed that eight of the assays could reliably detect ten flow-sorted oocysts in reagent water or environmental matrix. This study revealed that while a qPCR-based detection assay can be useful for detecting and differentiating different Cryptosporidium species in environmental samples, it cannot accurately measure low levels of oocysts that are typically found in drinking water sources.

Development and Evaluation of Three Real-Time PCR Assays for Genotyping and Source Tracking Cryptosporidium spp. in Water

“…For the detection of low levels of flow cytometrysorted C. parvum oocysts seeded in fecal specimens or water concentrates, the 18S-LC2 and hsp90 assays could detect a single oocyst, indicating that it is possible for these two assays to detect low levels of oocysts in water samples. A recent study comparing the sensitivities and specificities of 10 TaqMan-based real-time PCR assays showed that 8 of the assays could reliably detect 10 flow cytometry-sorted oocysts in reagent water or an environmental matrix (26). Therefore, the 18S-LC2 and hsp90 real-time PCR genotyping assays developed in this work likely have higher sensitivities in detecting Cryptosporidium oocysts in water and thus can be potentially used as rapid genotyping tools for environmental monitoring.…”

Quantificação e caracterização genotípica de Cryptosporidium spp.isolados de água bruta superficial e esgoto bruto para a monitorização em mananciais de abastecimento público na Região Metropolitana de São Paulo (RMSP)

“…Embora esta metodologia seja útil no monitoramento ela é incapaz de diferenciar entre espécies ou determinar infectividade dos oocistos presentes no ambiente aquático. Assim, as técnicas moleculares são alternativas promissoras para caracterização das espécies do parasito (STAGGS et al, 2013).…”

“…A qPCR é um sistema adaptado para detecção de sequências alvo que permite a determinação da variabilidade genética entre os isolados e medir a quantidade relativa de DNA acumulada ao final dos ciclos da reação (GUY et al, 2003;STOUP et al, 2006;ALONSO et al, 2011;RYU et al, 2010;STAGGS et al, 2013).…”

“…No entanto, estudos adicionais são necessários para avaliação mais precisa da aplicabilidade dessa metodologia e ainda, para compreender qual o significado para a saúde pública da detecção e identificação de espécies de Cryptosporidium no meio ambiente (STROUP et al, 2006;ALONSO et al, 2011;STAGGS et al, 2013). …”

“…A técnica de reação de amplificação em tempo real (qPCR) é considerada uma técnica promissora para detecção e quantificação de diferentes organismos em diversos tipos de amostras. A qPCR é um sistema adaptado para detecção de sequências alvo que permite a determinação da variabilidade genética entre os isolados e medir a quantidade relativa de DNA acumulada ao final dos ciclos da reação (GUY et al, 2003; STOUP et al, 2006;ALONSO et al, 2011;RYU et al, 2010;STAGGS et al, 2013).As vantagens em relação ao PCR convencional estão na redução do tempo do ensaio, redução de riscos de contaminação e aumento da sensibilidade. O procedimento segue o princípio geral da reação em cadeia pela polimerase, e sua característica fundamental é que o DNA amplificado é detectado por uma sonda específica fluorescente ou um corante de ligação ao DNA que emite um sinal após a hibridização com o DNA alvo complementar dupla-fita, assim a reação progride e pode ser acompanhada em tempo real (ALONSO et al, 2011).…”