Tailored Pyridoxal Probes Unravel Novel Cofactor‐Dependent Targets and Antibiotic Hits in Critical Bacterial Pathogens

Abstract

Unprecedented bacterial targets are urgently needed to overcome the resistance crisis. Herein we systematically mine pyridoxal phosphate‐dependent enzymes (PLP‐DEs) in bacteria to focus on a target class which is involved in crucial metabolic processes. For this, we tailored eight pyridoxal (PL) probes bearing modifications at various positions. Overall, the probes exceeded the performance of a previous generation and provided a detailed map of PLP‐DEs in clinically relevant pathogens including challenging Gram‐negative strains. Putative PLP‐DEs with unknown function were exemplarily characterized via in‐depth enzymatic assays. Finally, we screened a panel of PLP binders for antibiotic activity and unravelled the targets of hit molecules. Here, an uncharacterized enzyme, essential for bacterial growth, was assigned as PLP‐dependent cysteine desulfurase and confirmed to be inhibited by the marketed drug phenelzine. Our approach provides a basis for deciphering novel PLP‐DEs as essential antibiotic targets along with corresponding ways to decipher small molecule inhibitors.

Functionalised Cofactor Mimics for Interactome Discovery and Beyond

“…Additionally, a library of small molecules was screened for their antibiotic activity and two PLP-dependent enzymes were verified as targets of the marketed drug phenelzine. [26] Profiling a cofactor's interactome can also be accomplished using cofactor mimics functionalised with reactive electrophiles to transfer tags to nucleophilic residues in cofactor binding pockets. Some of the most established probes using this approach are ATP and ADP analogues developed to study protein kinases by leveraging conserved active site lysine residues.…”

“…More recently, additional probes (e.g. 1.5 and 1.6 ) have been developed, resulting in a total of 13 diverse PL mimics [26] . PLPome profiling of different pathogenic bacteria using this probe library revealed enhanced labelling coverage and five novel PLP‐DEs were further characterised by a series of in vitro activity assays.…”

Funktionalisierte Cofaktor‐Analoga für die Erforschung von Interaktomen und darüber hinaus

“…B. 1.5 – 1.6 ) entwickelt, wodurch nun insgesamt 13 verschiedene PL‐Sonden zur Verfügung stehen [26] . Die Erstellung von PLPom‐Profilen verschiedener pathogener Bakterien unter Verwendung dieser Sondenbibliothek ergab eine verbesserte Labellingabdeckung, und fünf neue PLP‐DEs wurden durch eine Reihe von In‐vitro‐Aktivitätsassays weiter charakterisiert.…”

“…Die Erstellung von PLPom‐Profilen verschiedener pathogener Bakterien unter Verwendung dieser Sondenbibliothek ergab eine verbesserte Labellingabdeckung, und fünf neue PLP‐DEs wurden durch eine Reihe von In‐vitro‐Aktivitätsassays weiter charakterisiert. Darüber hinaus wurde eine Bibliothek kleiner Moleküle auf ihre antibiotische Aktivität untersucht, und zwei PLP‐abhängige Enzyme konnten als Zielmoleküle des auf dem Markt befindlichen Medikaments Phenelzin bestätigt werden [26] . Das Profiling des Interaktoms eines Cofaktors kann auch mithilfe von Cofaktor‐Analoga durchgeführt werden, die mit reaktiven elektrophilen Gruppen funktionalisiert sind, um Tags auf nukleophile Reste in Cofaktor‐Bindungstaschen zu übertragen.…”

“…Darüber hinaus wurde eine Bibliothek kleiner Moleküle auf ihre antibiotische Aktivität untersucht, und zwei PLP-abhängige Enzyme konnten als Zielmoleküle des auf dem Markt befindlichen Medikaments Phenelzin bestätigt werden. [26] Das Profiling des Interaktoms eines Cofaktors kann auch mithilfe von Cofaktor-Analoga durchgeführt werden, die mit reaktiven elektrophilen Gruppen funktionalisiert sind, um Tags auf nukleophile Reste in Cofaktor-Bindungstaschen zu übertragen. Einige der bekanntesten Sonden mit diesem Ansatz sind ATP-und ADP-Analoga, die zur Untersuchung von Proteinkinasen entwickelt wurden.…”