Study of the strain variability of the behavior of Salmonella enterica

Abstract

Η διαστελεχιακή παραλλακτικότητα της μικροβιακής συμπεριφοράς είναι ένα γεγονός μεγάλης σημασίας για την έρευνα της ασφάλειας των τροφίμων. Δεδομένου αυτού, καθώς και του ότι τα διαθέσιμα ερευνητικά δεδομένα για τη διαστελεχιακή παραλλακτικότητα του παθογόνου Salmonella enterica είναι λίγα συγκριτικά με άλλα τροφoγενή παθογόνα, το αντικείμενο της παρούσας έρευνας ήταν η αξιολόγηση της διαστελεχιακής παραλλακτικότητας τριών βασικών πτυχών της συμπεριφοράς του παθογόνου: της αύξησης, της αδρανοποίησης και της ικανότητας σχηματισμού βιοϋμενίου. Για τον σκοπό αυτό, μελετήθηκαν 60 στελέχη S. enterica, ανήκοντα σε διάφορους ορότυπους. Στοχεύοντας στην αξιολόγηση της παραλλακτικότητας αύξησης μεταξύ στελεχών S. enterica ως συνάρτηση του περιβάλλοντος αύξησης, η κινητική συμπεριφορά των 60 στελεχών του παθογόνου αξιολογήθηκε στους 37°C σε θρεπτικό ζωμό tryptone soy broth με διαφορετικές τιμές pΗ (4.3-7.0) και συγκεντρώσεις NaCl (0.5-6.0%). Οι τιμές του μέγιστου ειδικού ρυθμού αύξησης (μmax) του κάθε στελέχους και για κάθε συνθήκη αύξησης προσδιορίστηκαν με βάση χρόνους ανίχνευσης απορρόφησης διαδοχικά και δεκαδικά αραιωμένων καλλιεργειών χρησιμοποιώντας το αυτοματοποιημένο σύστημα μέτρησης απορρόφησης Bioscreen C. Συνολικά παρήχθησαν 9600 καμπύλες οπτικής πυκνότητας. Η παραλλακτικότητα του μmax μεταξύ των στελεχών S. Enterica ήταν σημαντική και μεγαλύτερη από αυτή που παρατηρήθηκε εντός των στελεχών (μεταξύ των επαναλήψεων). Επιπλέον, η διαστελεχιακή παραλλακτικότητα αυξήθηκε όταν οι συνθήκες έγιναν περισσότερο δυσχερείς για την αύξηση του παθογόνου, τόσο σε επίπεδο pH όσο και NaCl. Ένα στοχαστικό μοντέλο το οποίο, ενσωματώνοντας τα δεδομένα διαστελεχιακής παραλλακτικότητας, παρέχει προβλέψεις μmax ως συνάρτηση του pΗ και της ενεργότητας νερού (aw) αναπτύχθηκε στη συνέχεια. Για τον σκοπό αυτό, χρησιμοποιηθήκαν κινητικά δεδομένα αύξησης των 60 στελεχών S. enterica, τα οποία παρήχθησαν κατά την παρακολούθηση της αύξησης του παθογόνου σε tryptone soy broth διαφορετικών τιμών pH (4.0-7.0) και aw (0.964-0.992). Οι επιδράσεις των περιβαλλοντικών παραμέτρων στον μmax μοντελοποιήθηκαν για κάθε στέλεχος S. Enterica χρησιμοποιώντας κατάλληλα για κάθε παράμετρο δευτερογενή μοντέλα. Ένα πολλαπλασιαστικό χωρίς αλληλεπιδράσεις μοντέλο, το οποίο συνδυάζει τα μοντέλα για το pH και την aw, χρησιμοποιήθηκε για να περιγράψει την συνδυασμένη επίδραση αυτών των δύο περιβαλλοντικών παραμέτρων στον μmax. Η διαστελεχιακή παραλλακτικότητα της αυξητικής συμπεριφοράς του παθογόνου S. Enterica ενσωματώθηκε στη διαδικασία μοντελοποίησης εισάγοντας τις αθροιστικές κατανομές πιθανότητας των τιμών pHmin, pHopt και awmin στο μοντέλο αύξησης. Η αθροιστική κατανομή πιθανότητας των παρατηρούμενων τιμών μmax σε pH 7.0-aw 23 0.992 εισήχθη στο μοντέλο στη θέση της παραμέτρου μopt. Η εισαγωγή των παραπάνω κατανομών στο μοντέλο αύξησης οδήγησε, μέσω της χρήσης προσομοίωσης Monte Carlo, σε ένα στοχαστικό μοντέλο αύξησης του οποίου οι προβλέψεις είναι κατανομές τιμών μmax, με τις τελευταίες να χαρακτηρίζουν τη διαστελεχιακή παραλλακτικότητα της αύξησης του παθογόνου. Το αναπτυχθέν μοντέλο στη συνέχεια αξιολογήθηκε έναντι ανεξάρτητων κινητικών δεδομένων αύξησης (δεδομένα μmax) για τα 60 στελέχη S. enterica σε pH 5.0-aw 0.977, και επέδειξε ικανοποιητική επίδοση. Αναφορικά με τη συμπεριφορά αδρανοποίησης του παθογόνου S. enterica, οι εγγενείς οξυ- και θερμο-ανθεκτικότητες των 60 στελεχών αξιολογήθηκαν σε tryptone soy broth χωρίς δεξτρόζη οξινισμένου σε pH 3.0 ή θερμισμένου στους 57°C. Συνολικά παρήχθησαν 360 καμπύλες αδρανοποίησης. Η διαστελεχιακή παραλλακτικότητα του ρυθμού όξινης αδρανοποίησης ήταν σημαντικά μεγαλύτερη από αυτή που παρατηρήθηκε για το ρυθμό θερμικής αδρανοποίησης, ενώ καμία συσχέτιση δεν παρατηρήθηκε μεταξύ αυτών των δύο κινητικών παραμέτρων. Επιπρόσθετα, καμία τάση μεταξύ των εξεταζόμενων στελεχών σε σχέση με την προέλευση, τον ορότυπο ή την ανθεκτικότητά τους σε αντιβιοτικά δεν ήταν εμφανής. Η ικανότητα σχηματισμού βιοϋμενίου των 60 στελεχών S. enterica αξιολογήθηκε σε διαφορετικές τιμές pH (3.8-7.0), συγκεντρώσεις NaCl (0.5-8.0%) και θερμοκρασίες (4-37°C). Συνολικά πραγματοποιήθηκαν 4320 δοκιμές σχηματισμού βιοϋμενίων (60 στελέχη × 12 διαφορετικές περιβαλλοντικές συνθήκες × 6 επαναλήψεις). Ο σχηματισμός βιοϋμενίου προσδιορίστηκε σε tryptone soy broth μετά από 48 h επώασης εντός πλαστικών μικροπλακετών ειδικού σχεδιασμού, χρησιμοποιώντας χρώση κρυσταλλικού ιώδους, και η ποσοτικοποίησή του στηρίχτηκε στη διαφορά μεταξύ της μετρούμενης οπτικής πυκνότητας των υπό εξέταση δειγμάτων και αρνητικών (μη εμβολιασμένων) μαρτύρων (ΔOD580nm). Τα εξεταζόμενα στελέχη σχημάτισαν βιοϋμένια σε μία ποικιλία περιβαλλοντικών συνθηκών, ενώ εκτεταμένη ήταν η παρατηρούμενη διαστελεχιακή παραλλακτικότητα αυτής της φαινοτυπικής απόκρισης. Η διαστελεχιακή παραλλακτικότητα του σχηματισμού βιοϋμενίου επηρεάστηκε και από τις τρεις περιβαλλοντικές παραμέτρους που εξετάστηκαν, και φάνηκε να αυξάνεται όσο οι περιβαλλοντικές συνθήκες γίνονταν λιγότερο ευνοϊκές για το παθογόνο. Επιπλέον, η αύξηση της διαστελεχιακής παραλλακτικότητας που προκλήθηκε από το pΗ ήταν σημαντικά μεγαλύτερη από αυτήν που προκλήθηκε από το NaCl ή τη θερμοκρασία. Οι βέλτιστες συνθήκες για σχηματισμό βιοϋμενίου, οδηγώντας στη μέγιστη ΔOD580nm, ήταν σημαντικά διαφορετικές μεταξύ των εξεταζόμενων στελεχών. Μεταξύ των συνθηκών που αξιολογήθηκαν, τα περισσότερα από τα στελέχη S. enterica σχημάτισαν τη μεγαλύτερη ποσότητα βιοϋμενίου σε pH 5.5, σε 0.5% NaCl και στους 25°C. Καμία σχέση δεν παρατηρήθηκε μεταξύ της ικανότητας σχηματισμού βιοϋμενίου των στελεχών και του ορότυπου τους, ή της κινητικής συμπεριφοράς αύξησής τους όπως αυτή είχε αξιολογηθεί προηγουμένως. Τα δεδομένα τα οποία παρήχθησαν στις μελέτες οι οποίες περιγράφονται στην παρούσα διατριβή αναμένεται να είναι χρήσιμα στη βελτίωση της κατανόησης της διαστελεχιακής παραλλακτικότητας, καθώς και στην επιλογή στελεχών με στόχο τη χρήση τους σε μελέτες πρόκλησης σχετικών με την ασφάλεια των τροφίμων. Επιπλέον, τα πειραματικά δεδομένα της συγκεκριμένης διατριβής έχουν αξία για την περιγραφή και την ενσωμάτωση της διαστελεχιακής παραλλακτικότητας της συμπεριφοράς του παθογόνου S. enterica στην ποσοτική μικροβιολογία και στον προσδιορισμό μικροβιακής επικινδυνότητας.