Strukturelle Untersuchung subviraler Partikel durch die Kombination von zellfreier Proteinherstellung mit 110 kHz MAS‐NMR‐Spektroskopie

Abstract

Virale Membranproteine sind vorrangige Ziele bei der Bekämpfung von Infektionen. Ihre Strukturbestimmung bleibt jedoche ine Herausforderung, sowohl in Bezug auf die Probenvorbereitung als auch auf die Methodologie der Strukturanalyse von Proteinen in einer Lipidmembranumgebung.Z ellfreie Proteinherstellung und Festkçrper-NMR-Spektroskopie sind vielversprechende Ansätzei nd iesem Zusammenhang,d er erstere in Bezug auf das hohe Potenzial, komplexeP roteine in nativer Form herzustellen und der letztere fürd ie Fähigkeit, Proteine in Lipiden analysieren zu kçnnen. Wirz eigen hier,d ass mg-Mengen des kleinen Hüllproteins des Enten-Hepatitis-B-Virus (DHBV) mittels zellfreier Herstellung produziert werden kçnnen, und dass die Proteine zu subviralen Partikeln zusammenlagern. Protonendetektierte 2D-NMR-Spektren, die bei 110 kHz schneller Probenrotation um den magischen Winkel und mit < 500 mg Protein aufgenommen wurden, zeigen eine Reihe von isolierten Signalen mit Linienbreiten, die vergleichbar zu denen von Modellmembranproteinen sind. Dies ebnet den Wegf ür strukturelle Studien dieser komplexen supramolekularen Proteinsysteme,d ie Homologe eines wichtigen Zielproteins für Arzneimittel in der HBV-Infektion sind.

Protein NMR Spectroscopy at 150 kHz Magic‐Angle Spinning Continues To Improve Resolution and Mass Sensitivity

“…However, with MAS frequencies approaching and exceeding 100 kHz, the linewidth for fully protonated proteins is reduced to a degree that makes proton-detected solid-state NMR an attractive alternative to carbon-13 detection. [18][19][20][21][22][23][24][25][26][27][28][29] Of course this holds true also for deuterated proteins that were back-exchanged to protons at exchangeable sites.…”

Dimer Organization of Membrane‐Associated NS5A of Hepatitis C Virus as Determined by Highly Sensitive 1H‐Detected Solid‐State NMR

“…[29,38] Only recently solid-state NMR, one of the most adequate methods to study membrane-bound proteins, [39][40][41][42][43][44] increased its mass sensitivity by as pectacular factor of > 100 through the more sensitive proton-detection possible under fast magic-angle spinning (MAS) NMR. [45][46][47][48][49] This technical advance makes the method now compatible with the analysis of an important class of proteins,w hich are eukaryotic membrane proteins from viruses [50,51] and humans. [52,53] As they can often only be produced in relatively small quantities (e.g.…”