Structural Context of Disease-Associated Mutations and Putative Mechanism of Autoinhibition Revealed by X-Ray Crystallographic Analysis of the EZH2-SET Domain

Abstract

The enhancer-of-zeste homolog 2 (EZH2) gene product is an 87 kDa polycomb group (PcG) protein containing a C-terminal methyltransferase SET domain. EZH2, along with binding partners, i.e., EED and SUZ12, upon which it is dependent for activity forms the core of the polycomb repressive complex 2 (PRC2). PRC2 regulates gene silencing by catalyzing the methylation of histone H3 at lysine 27. Both overexpression and mutation of EZH2 are associated with the incidence and aggressiveness of various cancers. The novel crystal structure of the SET domain was determined in order to understand disease-associated EZH2 mutations and derive an explanation for its inactivity independent of complex formation. The 2.00 Å crystal structure reveals that, in its uncomplexed form, the EZH2 C-terminus folds back into the active site blocking engagement with substrate. Furthermore, the S-adenosyl-L-methionine (SAM) binding pocket observed in the crystal structure of homologous SET domains is notably absent. This suggests that a conformational change in the EZH2 SET domain, dependent upon complex formation, must take place for cofactor and substrate binding activities to be recapitulated. In addition, the data provide a structural context for clinically significant mutations found in the EZH2 SET domain.

Histone lysine methyltransferases as anti-cancer targets for drug discovery

“…Mutations of the Y641 residue within the catalytic SET domain of EZH2 occur in 22% of diffuse large B-cell lymphomas (DLBCLs) and follicular lymphomas (FL) [38,39] , and 8%-24% of non-Hodgkin lym phomas (NHL) [40] . Homology modeling [41,42] and the solved apo-structure of the EZH2 SET domain [43,44] have disclosed Y641 as a key amino acid for substrate specificity. Mutations of Y641 into other smaller amino acids, such as phenylalanine (F), serine (S), histidine (H) and cysteine (C) resulted in changes in pocket dimensions, as well as hydrogen bonding, which allowed the free rotation of H3K27me2 and subsequent tri-methylation to H3K27me3 (a transcriptionally repressive mark) and led to repression of key tumor suppressor genes [45,46] .…”

Regulação epigenética da expressão gênica de <i>Schistosoma mansoni</i> induzida por inibidor de histona deacetilase

“…Com essa observação em mãos, levantamos a hipótese de que ao se adicionar um iEZH2 juntamente com o iHDAC poderiamos reduzir ainda mais a atividade do complexo PRC2, desencadeando um efeito maior de desregulação da cromatina e induzindo a morte. A partir desta hipótese, testamos o inibidor GSK343, que já havia sido descrito em humanos como sendo um competidor do cofator SAM de hEZH2 no domínio SET (Antonysamy, Condon et al 2013), e observamos que somente o iEZH2 não induzia grande mortalidade em esquistossômulos. Porém ao adicionar o iHDAC (TSA), notamos um aumento significativo da mortalidade, indicando um possível sinergismo entre TSA e GSK343, supostamente pelo mecanismo proposto acima.…”

“…Assim, acreditamos que inibidores de enzimas modificadoras de cromatina podem atuar por alterar a expressão de genes e desregular mecanismos da cromatina, além de agir sinergicamente para desencadear a morte celular no parasita. DISCUSSÃO Ao contrário do TSA que não possui afinidade por uma única HDAC, GSK343 foi desenvolvido para inibir especificamente a hEZH2 (Verma, Tian et al 2012, Antonysamy, Condon et al 2013. A alta similaridade entre SmEZH2 e hEZH2 permitiram gerar um modelo in silico da estrutura da histona metiltransferase de S. mansoni.…”

“…Com o modelo do domínio SET testamos se GSK343 poderia se ligar à SmEZH2, e verificamos que a droga pode estar inibindo a enzima por competição com o cofator SAM, e com isso aumentando a mortalidade dos esquistossômulos como mostrado no ensaio de sinergismo de drogas. Na literatura há indicação de quais aminoácidos de hEZH2 interagem com SAM (Figura 15) (Antonysamy, Condon et al 2013), e ao analisarmos in silico a ligação de SAM com SmEZH2 notamos que alguns aminoácidos são os mesmos que interagem com SAM em hEZH2, porém a maioria dos aminoácidos são distintos, indicando que SAM interage na mesma região da proteína mas mantém interações com resíduos diferentes. Ao realizarmos esta mesma análise com GSK343 vimos que há um grande compartilhamento de aminoácidos de SmEZH2 que interagem com a droga e com o cofator, indicando a possível inibição competitiva.…”

“…Além disso, a estrutura cristalizada de hEHZ2 revelou que quando a enzima não está complexada com as proteínas associadas, a porção C-terminal se dobra para dentro do sítio catalítico bloqueando a ligação ao substrato (Antonysamy, Condon et al 2013). A região com os aminoácidos do domínio SET de hEZH2 que tem contato com o cofator SAM (Antonysamy, Condon et al 2013) O cálculo da energia livre de ligação entre SmEZH2 e GSK343 ou entre SmEZH2 e SAM mostrou que ela é mais negativa no primeiro caso (Figura 16, B), sugerindo uma maior afinidade da enzima pela droga comparada ao cofator natural, apesar do cofator interagir com maior número de aminoácidos. Valores semelhantes foram encontrados para a interação de hEZH2 com GSK343 ou SAM, porém a predição de acoplamento mostrou que esta interação ocorre com alguns aminoácidos diferentes comparado com SmEZH2.…”