Solid-Supported Proteins in the Liquid Chromatography Domain to Probe Ligand-Target Interactions

Abstract

Ligand-target interactions play a central role in drug discovery processes because these interactions are crucial in biological systems. Small molecules-proteins interactions can regulate and modulate protein function and activity through conformational changes. Therefore, bioanalytical tools to screen new ligands have focused mainly on probing ligand-target interactions. These interactions have been evaluated by using solid-supported proteins, which provide advantages like increased protein stability and easier protein extraction from the reaction medium, which enables protein reuse. In some specific approaches, precisely in the ligand fishing assay, the bioanalytical method allows the ligands to be directly isolated from complex mixtures, including combinatorial libraries and natural products extracts without prior purification or fractionation steps. Most of these screening assays are based on liquid chromatography separation, and the binding events can be monitored through on-line or off-line methods. In the on-line approaches, solid supports containing the immobilized biological target are used as chromatographic columns most of the time. Several terms have been used to refer to such approaches, such as weak affinity chromatography, high-performance affinity chromatography, on-flow activity assays, and high-performance liquid affinity chromatography. On the other hand, in the off-line approaches, the binding event occurs outside the liquid chromatography system and may encompass affinity and activity-based assays in which the biological target is immobilized on magnetic particles or monolithic silica, among others. After the incubation step, the supernatant or the eluate from the binding assay is analyzed by liquid chromatography coupled to various detectors. Regardless of the selected bioanalytical approach, the use of solid supported proteins has significantly contributed to the development of automated and reliable screening methods that enable ligands to be isolated and characterized in complex matrixes without purification, thereby reducing costs and avoiding time-laborious steps. This review provides a critical overview of recently developed assays.

Co-Immobilized Capillary Enzyme Reactor Based on Beta-Secretase1 and Acetylcholinesterase: A Model for Dual-Ligand Screening

“…In this context, robust screening assays that employ enzymes immobilized on solid supports have received increasing attention because they offer advantages like improved stability and the possibility of proteins being reused (de Moraes et al, 2016). Such screening assays are based on bioaffinity chromatography, which combines the specificity and sensitivity of an enzymatic reaction with the automation and reproducibility of a chromatographic system (Acker and Auld, 2014;de Moraes et al, 2019).…”

Enzimas calicreína e ciclooxigenase imobilizadas: Estudo de condições para triagem de inibidores

“…Assim, para superar as limitações dos ensaios existentes, novas abordagens têm sido desenvolvidas, como por exemplo, o uso de enzimas imobilizadas. Nesse contexto, os ensaios baseados em enzimas imobilizadas têm se destacado como uma alternativa promissora aos ensaios de triagem convencionais CASS, 2019;DE SIMONE et al, 2019;FU et al, 2019;TRINDADE XIMENES et al, 2021;ZHUO et al, 2016).…”

“…Em comparação às enzimas livres em solução, a utilização das enzimas imobilizadas apresenta diversas vantagens, como por exemplo, o aumento da estabilidade da enzima em relação à temperatura, presença de solventes orgânicos e variação de pH sem perda considerável da atividade catalítica CASS, 2009;HOMAEI et al, 2013;MOHAMAD et al, 2015). Além disso, os sistemas heterogêneos de enzimas imobilizadas permitem a fácil recuperação e reutilização das enzimas em vários ciclos de reação, representando uma economia significativa em processos que requerem enzimas caras CASS, 2019;HOMAEI et al, 2013;MOHAMAD et al, 2015). Deste modo, a técnica de imobilização enzimática têm sido amplamente empregada nas mais diversas áreas de pesquisa, como por exemplo, na produção de biocombustíveis, na área de alimentos, na degradação de corantes, bem como na área médica para diagnósticos de doenças e pesquisa por novos fármacos, entre outras (BASSO; SERBAN, 2019;HOMAEI et al, 2013).…”

“…Nos últimos anos, grande interesse tem sido direcionado para desenvolvimento e a aplicação de novos ensaios de triagem que permitam a descoberta e identificação de moléculas bioativas de uma maneira mais rápida e mais eficiente. Nesse contexto, os ensaios baseados em enzimas imobilizadas têm se destacado como uma ferramenta promissora para a triagem de ligantes CASS, 2019;GUO et al, 2019;TRINDADE XIMENES et al, 2021;WOUTERS et al, 2021). Em comparação com as enzimas livres em solução, as enzimas imobilizadas são mais robustas e mais resistentes às mudanças reacionais, e são facilmente separadas da mistura reacional, permitindo a sua recuperação e reutilização em vários ciclos de reação (CARDOSO; MORAES; CASS, 2009;HOMAEI et al, 2013;MOHAMAD et al, 2015).…”

“…Em comparação com as enzimas livres em solução, as enzimas imobilizadas são mais robustas e mais resistentes às mudanças reacionais, e são facilmente separadas da mistura reacional, permitindo a sua recuperação e reutilização em vários ciclos de reação (CARDOSO; MORAES; CASS, 2009;HOMAEI et al, 2013;MOHAMAD et al, 2015). Além disso, as enzimas imobilizadas permitem uma variedade de formatos de ensaios e podem ser utilizadas em reatores de processo contínuo em ensaios em fluxo para a triagem rápida de novos ligantes para a enzima alvo CASS, 2019;DE SIMONE et al, 2019;FANG et al, 2012;WOUTERS et al, 2021).…”