RNPomics: Defining the ncRNA transcriptome by cDNA library generation from ribonucleo-protein particles

Abstract

Up to 450 000 non-coding RNAs (ncRNAs) have been predicted to be transcribed from the human genome. However, it still has to be elucidated which of these transcripts represent functional ncRNAs. Since all functional ncRNAs in Eukarya form ribonucleo-protein particles (RNPs), we generated specialized cDNA libraries from size-fractionated RNPs and validated the presence of selected ncRNAs within RNPs by glycerol gradient centrifugation. As a proof of concept, we applied the RNP method to human Hela cells or total mouse brain, and subjected cDNA libraries, generated from the two model systems, to deep-sequencing. Bioinformatical analysis of cDNA sequences revealed several hundred ncRNP candidates. Thereby, ncRNAs candidates were mainly located in intergenic as well as intronic regions of the genome, with a significant overrepresentation of intron-derived ncRNA sequences. Additionally, a number of ncRNAs mapped to repetitive sequences. Thus, our RNP approach provides an efficient way to identify new functional small ncRNA candidates, involved in RNP formation.

Une approche originale de sélection de nouveaux ARN non codants

“…Les ARN dégra-dés non associés à des protéines ou les sousunités ribosomiques que l'on trouve au sommet du gradient ou dans le culot respectivement, sont exclus du processus, ce qui permet d'évi-ter qu'ils soient ensuite séquencés en majorité. Adapté avec la permission de [7]. …”

“…Ainsi, il a été suggéré qu'une part importante des transcrits restants (88,5 %) pouvaient constituer la source de nouveaux ARNnc régulateurs [11]. Certains auteurs prédisent même génération de banques d'ADN complé-mentaires (ADNc) des ARNnc [7,8]. Jusqu'alors, ce type de banques était généré à partir d'ARN nus extraits au phénol-chloroforme et séparés sur gel de polyacrylamide dénaturant, ce qui permettait une sélection selon leur taille des molécules à inclure dans la banque [9,10].…”

“…Toutefois, l'inconvénient majeur de ces banques était qu'elles contenaient de façon majoritaire des produits de dégradation non fonctionnels d'ARN ribosomiques ou d'ARN messagers, parfois dans des proportions supérieures à 90 % [10], masquant et empêchant ainsi, lors du séquençage, l'identification de nouvelles molécules plus rares. Notre nouvelle approche est basée sur la sélection de RNP en conditions natives sur gradient de glycérol en amont de l'étape d'isolement des ARN (Figure 1), ce qui permet d'enrichir les banques en ARN fonctionnels inclus dans des RNP, contrairement à l'approche traditionnelle, et d'identifier de nouveaux ARNnc régulateurs [7]. La comparaison des séquences obtenues pour deux banques d'ARNnc issus de cerveaux de souris pré-parées selon les deux approches est sans ambiguïté (Figure 2).…”

“…La comparaison des séquences obtenues pour deux banques d'ARNnc issus de cerveaux de souris pré-parées selon les deux approches est sans ambiguïté (Figure 2). Alors que près de la moitié des séquences obtenues avec une approche classique correspondent à des fragments d'ARN ribosomiques non fonctionnels [9], ce pourcentage n'est que de 2 % avec l'approche par sélection des RNP, ce qui a permis d'obtenir 98 % d'ARNnc fonctionnels dans la banque [7]. Par une approche à haut-débit, le séquençage de cette banque a en outre permis d'identifier environ un millier de nouveaux candidats petits ARNnc dont la caractérisation fonctionnelle est en cours [7].…”

“…Alors que près de la moitié des séquences obtenues avec une approche classique correspondent à des fragments d'ARN ribosomiques non fonctionnels [9], ce pourcentage n'est que de 2 % avec l'approche par sélection des RNP, ce qui a permis d'obtenir 98 % d'ARNnc fonctionnels dans la banque [7]. Par une approche à haut-débit, le séquençage de cette banque a en outre permis d'identifier environ un millier de nouveaux candidats petits ARNnc dont la caractérisation fonctionnelle est en cours [7]. L'obtention de banques à partir des RNP constitue donc une bonne alternative aux protocoles existants, et permet une étude du transcriptome par des approches de séquençage à haut-débit (technologie RNAseq) [8].…”