Remodelling of Lipid Rafts during In vitro Capacitation and Acrosome Reaction of Ram Spermatozoa

Abstract

Background: Lipid rafts are often known as Detergent-Resistant Microdomains (DRMs). We report for the first time the presence of two lipid raft markers, caveolin-1 and ganglioside GM1, on the ram sperm surface, and the effect of in vitro capacitation and acrosome reaction on these marker distributions, the protein content and lipid composition of DRM and non-DRM fractions. Methods:Caveolin-1 and ganglioside GM1 were evidenced by immunocytochemical and fluorescence analysis, respectively. DRM and non-DRM fractions were separated by an OptiPrep TM density gradient. Cholesterol by fluorometry, GM1 by peroxidase reaction, protein content by spectrophotometry, and fatty acid profiling by gas chromatography were determined.Results: Caveolin-1 was evidenced at the acrosome of 59.2 ± 4.3% fresh spermatozoa, and the proportion of stained cells increased (P<0.05) after capacitation. GM1 was detected at the post-acrosome and tail of all spermatozoa, and no change was found after capacitation. Cholesterol and GM1 were distributed all along the gradient, with a peak in DRM fractions. A higher proportion (P<0.001) of saturated fatty acids was found in DRM fractions, confirmed by the unsaturation index and a higher lipid/protein ratio. In vitro capacitation induced a decrease in the content of saturated fatty acids in both DRM (P<0.001) and non-DRM (P<0.01) fractions. Polyunsaturated fatty acids increased in DRMs after the acrosome reaction. All treatments resulted in lower content of cholesterol and proteins in DRM (P<0.01) and non-DRM fractions (P<0.001), and a higherGM1 content in DRMs (P < 0.05). Conclusions:Lipid raft-like microdomains were isolated in a discrete region of the gradient. Their high content of saturated fatty acids confers a highly ordered environment. Their composition is modified during in vitro capacitation and acrosome reaction. General significance:These results represent the first characterization of ram sperm DRM, and may contribute to a better understanding of the sperm fertilizing potential acquisition mechanism.

Signalling Events and Associated Pathways Related to the Mammalian Sperm Capacitation

“…In noncapacitated spermatozoa, heparin-binding proteins are confined to the subacrosomal region, and in capacitated spermatozoa, they are found in the acrosomal region. Redistribution and localization pattern of heparinbinding proteins reflect the state of capacitation (Dapino et al 2009). Heparin modulates intracellular environment by facilitating the entry of calcium into the cytosol, consequently, increasing pH and thus alkalinization.…”

Determinación de la distribución de balsas lipídicas (lipid rafts) y cuantificación del colesterol de la membrana de espermatozoides criopreservados de cerdo

“…Las diferencias entre los espermatozoides no capacitados y descongelados, respecto alpatrón A, fueron significativas (p<0.005) mientras que para los patrones B y C no se observaron. Los patrones de fluorescencia observados muestran que el patrón A es el que se ve afectado con el proceso de congelación, es decir, la distribución del gangliósido M1 es modificado en gran parte de la membrana de los espermatozoides.Durante la capacitación in vitro, la BSA del medio de incubación colabora con la pérdida de colesterol, lo que inicia el proceso de capacitación espermática y se ha asociado a esto una migración de GM1 hacia la región de la cabeza de los espermatozoides de cerdos (Flesch et al 2001, Shadan et al 2004, humanos (Nixon et al 2011) y carneros (Colas et al 2012); dicha migración se considera como un indicador de la capacitación espermática en una muestra (Shadan et al 2004, Bou Khalil et al 2006, Colas et al 2012. En el grupo de espermatozoides no capacitados, la concentración de colesterol fue de 183.6 ±15.2, siendo la mayor de todas las muestras analizadas.…”

“…Al iniciar la capacitación, los espermatozoides comenzaron a perder colesterol de la membrana plasmática, por lo que se encontró una alta cantidad de colesterol en el medio de los espermatozoides capacitados (349.5 ±25.3). Nuestros datos confirman los de otros autores que mencionan que la capacitación está relacionada con la pérdida de colesterol de la membrana plasmática (Colas et al 2012). La liberación de colesterol aumenta considerablemente la fluidez de la membrana, provocando cambios en algunas moléculas, como el GM1, que es desplazado de la región del flagelo a la región de la cabeza.…”

“…Por otra parte, las balsas lipídicas funcionan como plataformas de señalización donde se concentra gran parte de proteínas implicadas en ella (Simons y Ikonen 1997 ). Se ha demostrado que las balsas lipídicas se encuentran en células somáticas que están presentes en los espermatozoides de mamíferos, con una morfología diferenciada que se refleja en la superficie de su membrana (Colas et al 2012). Se sabe que participan en la modulación de aspectos claves de la maduración del espermatozoide y las interacciones del espermatozoide-ovocito (Nixon et al 2011, Colas et al 2012.…”

“…Las muestras se analizaron con ayuda delmicroscopio de epifluorescenciaAxiostar plus, ZEISS®, a una longitud de onda de495 nm excitación y 525 nm emisión, a un aumento de 100 X. Para cada tratamiento, se contaron 200 espermatozoides y se analizaron los diferentes patrones de fluorescencia (Colas et al 2012).…”