Regulação da expressão do gene cScratch2 na embriogênese neural.

Abstract

O desenvolvimento neural inicia-se através da neurulação. Com o fechamento do tubo neural, forma-se uma camada de células proliferativas que caracterizam a zona ventricular. A transição de uma célula proliferativa para o estado pós-mitótico é um processo intensamente regulado através de genes proneurais. Os eventos posteriores de diferenciação são regidos por uma cascata molecular bem definida, que também está intimamente ligada ao processo de migração neural. Dentre os genes de diferenciação, Scratch2 (Scrt2) é um fator de transcrição expresso em células neurais recém-egressas do ciclo mitótico, responsável pela sobrevivência, diferenciação e migração. cScrt2 é expresso em uma população bastante restrita de células na camada interna da zona intermediária do tubo neural de embriões de galinha, e este padrão se mantém conservado em outros vertebrados. Apesar disso, o mecanismo de regulação de sua transcrição permanece desconhecido. Como tal, a ausência de Scrt2 na região subventricular e ventricular sugere que sua expressão possa ser controlada por fatores de transcrição presentes nestas regiões. Neste trabalho, nós buscamos por potenciais elementos cis-regulatórios na região gênômica de cScrt2 e por possíveis sítios de ligação para fatores de transcrição. Nós testamos a função biológica da região cis-regulatória intrônica através de eletroporação de um plasmídeo repórter em embrião de galinha. A região cis-regulatória candidata à enhancer de cScrt2 eletroporada no tubo neural, levou à expressão de eGFP no tubo neural, contudo, não simulou o padrão de expressão do cScrt2 endógeno. Estes dados sugerem que a região cis-regulatória candidata contribui com o controle da expressão de cScrt2, mas que talvez também necessite da interação com outras regiões regulatórias. Nós também verificamos o papel dos fatores de transcrição mAsh1, cPax6, cNgn2 e Brn na regulação da expressão de cScrt2 através da superexpressão destes fatores no tubo neural de galinhas em desenvolvimento. As análises da expressão gênica foram realizadas através de qPCR e hibridação in situ. mAsh1 levou a um leve aumento na expressão de cScrt2 endógeno, visto através da hibridação in situ. Já a superexpressão de cPax6 e mBrn-Eng reduziu os níveis de cScrt2, com Brn apresentando efeitos mais severos. Por fim, nós propomos que Brn possa inibir a transcrição de cScrt2 indiretamente através de cNgn2 ou mediante sua ligação direta aos elementos cis de cScrt2. The morphological aspects of neural development start with neurulation. The closed neural tube contains a layer of proliferating cells that characterize the ventricular zone. The transition from a proliferative to a post-mitotic state is a process strongly regulated by proneural genes. The posterior differentiation events are controlled by a well-defined molecular cascade, which is also closely linked to the neural migration process. Scratch2 (Scrt2) is a transcription factor expressed in early post-mitotic neural cell responsible for survival, differentiation and migration. cScrt2 is expressed in a ve...