Recombinant Human Insulin

Tikhonov, Roman V.; Pechenov, Sergey E; Belacheu, Irina A.; Yakimov, S. A.; Klyushnichenko, Vadim; Boldireva, Elena F.; Korobko, V. G.; Tunes, Heloisa; Thiemann, J. E.; Vilela, Luciano; Wulfson, A. N.

doi:10.1006/prep.2000.1345

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“…26 Como exemplos de proteínas recombinantes com cauda de histidina purificadas por IMAC em nível de bancada, podem-se citar pró-renina humana, 83 β-galactosidase e peroxidase de raiz forte 84,85 e, em nível industrial, a pró-insulina humana. 86 Pró-renina humana produzida em células de ovário de hamster chinês (CHO), tendo uma cauda de 10 histidinas, foi purificada por IMAC, fazendo-se uso de colunas comerciais Talon ® -Co 2+ . Esta proteína, que é a precursora da renina, apresenta potenciais funções fisiológicas.…”

Section: Exemplos De Aplicações De Imacunclassified

“…84,85 A pró-insulina humana recombinante tendo uma cauda de histidina, produzida pela indústria brasileira BIOMM (Montes Claros, MG, Brasil) foi purificada por IMAC em géis de agarose-IDA-Ni 2+ , segundo procedimento descrito por Tikhonov e colaboradores. 86 Como os custos de recuperação e purificação de produtos chegam a representar uma porcentagem significativa do custo total, a minimização do número de etapas e do tempo do processo reduz enormemente o custo do produto. Com o intuito de reduzir o número de etapas do processo, Aquino e colaboradores propuseram a purificação de pró-insulina humana recombinante com cauda de histidina em membranas de fibras ocas de álcool (poli (etileno vinílico)) com o íon níquel quelatado ao IDA, devido à vantagem em relação aos géis tradicionais, de tratar grandes volumes por unidade de tempo e alimentar soluções contendo material particulado.…”

Section: Exemplos De Aplicações De Imacunclassified

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Cromatografia de afinidade por íons metálicos imobilizados (IMAC) de biomoléculas: aspectos fundamentais e aplicações tecnológicas

Bresolin¹,

Miranda²,

Bueno³

2009

Quím. Nova

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Recebido em 16/7/08; aceito em 16/12/08; publicado na web em 11/5/09 IMMOBILIZED METAL-ION AFFINITY CHROMATOGRAPHY (IMAC) OF BIOMOLECULES: FUNDAMENTAL ASPECTS AND TECHNOLOGICAL APPLICATIONS. Immobilized Metal Ion Affinity Cromatography -IMAC -is a group-specific based adsorption applied to the purification and structure-function studies of proteins and nucleic acids. The adsorption is based on coordination between a metal ion chelated on the surface of a solid matrix and electron donor groups at the surface of the biomolecule. IMAC is a highly selective, low cost, and easily scaled-up technique being used in research and commercial operations. A separation process can be designed for a specific molecule by just selecting an appropriate metal ion, chelating agent, and operational conditions such as pH, ionic strength, and buffer type.Keywords: immobilized metal-ion affinity chromatography; purification; biomolecules. INTRODUÇÃOOs princípios fundamentais da afinidade de biomoléculas por íons metálicos são conhecidos desde o início do século passado. Em 1974, Everson e Parker demonstraram que íons metálicos presentes em metaloproteínas são os principais responsáveis pela adsorção dessas em resinas contendo quelantes imobilizados e exploraram esta afinidade na separação deste tipo de proteínas. 1 A técnica proposta por Everson e Parker popularizou-se com o trabalho publicado por Porath e colaboradores em 1975, quando os autores introduziram o termo cromatografia de afinidade por íons metálicos imobilizados (Immobilized Metal-Ion Affinity Chromatography -IMAC). 2 IMAC explora a interação entre espécies doadoras de elétrons presentes na superfície de biomoléculas em solução e íons metálicos quelatados imobilizados em um suporte sólido. Inúmeras são as aplicações analíticas, preparativas e industriais de IMAC, como a separação e purificação de diferentes biomoléculas (peptídeos, proteínas e ácidos nucléicos), a separação de células a partir de extratos biológicos e estudos de estrutura-função de proteínas.Inicialmente a técnica de IMAC foi extensamente utilizada para purificação de biomoléculas contendo naturalmente grupos doadores de elétrons em resíduos de aminoácidos expostos na superfície (tais como o anel imidazol de histidina), os quais são primariamente responsáveis pela interação biomolécula-íon metálico. Com o advento da tecnologia do DNA recombinante, foi possível a incorporação de caudas (tag) em proteínas que não contêm naturalmente espécies doadoras de elétrons, tal como a fusão de sequência de seis histidinas na porção C ou N-terminal da proteína alvo, conferindo à mesma a possibilidade de purificação por IMAC. 3,4 Apesar de na literatura existirem excelentes artigos de revisão em inglês sobre IMAC 5-14 , nesta revisão, devido à intensa atividade neste campo, pretende-se abordar aspectos fundamentais, aplicações tecnológicas (escala de laboratório e industrial) e científicas com ênfase na purificação de proteínas nativas e recombinantes (com cauda de poli(histidina)). Dentre os aspectos fundamentais do mé...

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Section: Exemplos De Aplicações De Imacunclassified

Cromatografia de afinidade por íons metálicos imobilizados (IMAC) de biomoléculas: aspectos fundamentais e aplicações tecnológicas

Bresolin¹,

Miranda²,

Bueno³

2009

Quím. Nova

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“…The six Cys in proinsulin fusion protein form a CysS(SO 3 H) 6 derivative (S‐sulfonate), which increases the protein's polyelectrolytic properties and improves the efficiency of isolation. Folding of the fusion protein S‐sulfonate occurred with high yield (up to 90–95%) because the fusion protein–S‐sulfonate had proinsulin‐like secondary structure allowing highly efficient folding 9, 10. S‐Sulfonation of transthyretin (TTR), a marker for molybdenum cofactor deficiency and a fatal neurological disorder, was studied by ESI‐MS following selective enrichment of TTR by immunoprecipitation using protein G/A agarose.…”

mentioning

confidence: 99%

Selective detection of thiosulfate‐containing peptides using tandem mass spectrometry

Raftery¹

2005

Rapid Comm Mass Spectrometry

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Incubation of proteins or peptides containing disulfide bonds (S-S) with sodium sulfite (Na(2)SO(3)) cleaves S-S bonds producing approximately equimolar amounts of free thiols (-SH) and thiosulfates (-S-SO(3)H), a process known as sulfitolysis. Proteins and peptides containing thiosulfates were separated by reverse-phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) and characterized by mass spectrometry (MS) and peptide mapping. The mass of the thiosulfate-containing peptide formed from oxidized insulin B chain was 3478.02 Da, 80 Da greater than the reduced peptide and corresponding precisely to addition of sulfur trioxide (SO(3)). Disulfide bond cleavage was also observed using RP-HPLC and MS after incubation of the intramolecular homodimer of mouse S100A8 (mass 20614 Da). The mass of HPLC-separated A8-SH was 10308 Da, and 10388 Da for A8-S-SO(3)H. Loss of SO(3) from multiply charged precursor ions was generally observed at elevated declustering potentials in the source region or within q(2) at relatively low collision energies (approximately 20 V). The characteristic loss of SO(3) at low collision energies preceded peptide backbone fragmentations at higher collision energies. Accurate mass measurement and charge-state discrimination, using a hybrid quadrupole time-of-flight mass spectrometer, allowed specific detection of thiosulfate-containing peptides. An information-dependent acquisition method, where the switch criterion was loss of m/z 79.9568, specifically identified 11 thiosulfate-containing peptides using nano-LC/MS from a tryptic digest of bovine serum albumin (BSA).

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“…For the experiments with cSPI, solutions containing about 70 mg of total protein (cSPI diluted 1:1 in the adsorption buffer) were loaded into the column. After protein injection, the column was washed using a sequence of buffer C containing 0.020 mol/L of imidazole; buffer C, and buffer C containing 6.0 mol/L urea until no protein was detected in the column out-stream [10]. Adsorbed proteins were subsequently eluted with buffer C containing 6.0 mol/L urea and 0.1 mol/L of imidazole.…”

Section: Fixed-bed Chromatographic Experimentsmentioning

confidence: 99%

“…Among many fusion-separation method systems, the histidine tag-immobilized metal ion affinity chromatography (His tag-IMAC) has been used to routinely purify a large variety of recombinant proteins from glutaryl acylase to insulin and at laboratory and commercial scale, using fixed and expanded beds [6][7][8][9][10][11][12][13]. IMAC is based on the fact that accessible histidine (His) * Corresponding author.…”

Section: Introductionmentioning

confidence: 99%

Evaluation of IDA-PEVA hollow fiber membrane metal ion affinity chromatography for purification of a histidine-tagged human proinsulin

Aquino

Sousa²,

Miranda

et al. 2006

Journal of Chromatography B

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Recombinant Human Insulin

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Cromatografia de afinidade por íons metálicos imobilizados (IMAC) de biomoléculas: aspectos fundamentais e aplicações tecnológicas

Cromatografia de afinidade por íons metálicos imobilizados (IMAC) de biomoléculas: aspectos fundamentais e aplicações tecnológicas

Selective detection of thiosulfate‐containing peptides using tandem mass spectrometry

Evaluation of IDA-PEVA hollow fiber membrane metal ion affinity chromatography for purification of a histidine-tagged human proinsulin

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