Reassembly and co-crystallization of a family 9 processive endoglucanase from its component parts: Structural and functional significance of the intermodular linker

Abstract

Non-cellulosomal processive endoglucanase 9I (Cel9I) from Clostridium thermocellum is a modular protein, consisting of a family-9 glycoside hydrolase (GH9) catalytic module and two family-3 carbohydrate-binding modules (CBM3c and CBM3b), separated by linker regions. GH9 does not show cellulase activity when expressed without CBM3c and CBM3b and the presence of the CBM3c was previously shown to be essential for endoglucanase activity. Physical reassociation of independently expressed GH9 and CBM3c modules (containing linker sequences) restored 60-70% of the intact Cel9I endocellulase activity. However, the mechanism responsible for recovery of activity remained unclear. In this work we independently expressed recombinant GH9 and CBM3c with and without their interconnecting linker in Escherichia coli. We crystallized and determined the molecular structure of the GH9/linker-CBM3c heterodimer at a resolution of 1.68 Å to understand the functional and structural importance of the mutual spatial orientation of the modules and the role of the interconnecting linker during their re-association. Enzyme activity assays and isothermal titration calorimetry were performed to study and compare the effect of the linker on the re-association. The results indicated that reassembly of the modules could also occur without the linker, albeit with only very low recovery of endoglucanase activity. We propose that the linker regions in the GH9/CBM3c endoglucanases are important for spatial organization and fixation of the modules into functional enzymes.

Explorando as relações entre estrutura e função das hidrolases de glicosídeos das famílias 9, 48 e 74

“…No geral, esse sítio para cálcio parece ser conservado na família GH9, como já observado anteriormente em outros trabalhos. 45,53,197 Entretanto, quando avaliada a influência de cálcio na atividade enzimática de BlCel9, não foi observado qualquer aumento; isso sugere que esse íon tem um papel mais estrutural do que funcional, como observado em outros trabalhos em que o cálcio tem importante melhora na termoesbilidade enzimática e aumento da afinidade do substrato dentro do sítio catalítico. 189,190,200 5.1.3.1 Domínio de ligação à celulose Domínios de ligação à celulose da família 3 são largamente observados estando associados à GHs bacterianas.…”

“…201 O domínio de ligação à celulose da subfamília 3c, CBM3c, é composto por 9 folhas-beta antiparalelas formadas por 151 resíduos de aminoácidos, apresentando topologia do tipo beta-sandwich e um motivo tipo jelly roll, motivo este observado em estruturas de CBMs da família 3 de homólogos determinadas anteriormente. 45,53,197,201 As folhas 1, 2, 4, e 7 formam uma face quase planar rica em resíduos polares e carregados em sua superfície. Essa região planar do domínio CBM3c é perfeitamente alinhada com a cavidade que forma o bolsão catalítico do domínio catalítico, indicando que ambos podem constituir uma unidade funcional conjunta.…”

“…Na parte oposta do CBM3c, as folhas-beta 3, 5, 6, 8 e 9 formam uma face com uma cavidade rasa (Figura 36), já descrita para CBMs da família 3; 201 embora não se saiba ainda o papel funcional desda região no CBM3c, as suposições feitas em outros trabalhos são que ela pode interagir com oligossacarídeos e até mesmo com regiões do linker peptídico que conecta o CBM ao CD. 197 Localizado entre a folhabeta 3 e os loops Asp507-Ala518 e Ser574-Asp587, um segundo íon cálcio (Figura 36) é observado octacoordenado pelos resíduos Asp507 (2,34 Å), Glu510 (2,30 Å), Asn583 (2,34 Å), Asn586 (2,33 Å), Asp587 (3,91 Å), e H2O (2,36 Å); isso também é observado nas estruturas de Tf Cel9A, CcCel9G, e CtCel9I, as quais provavelmente também têm um papel mais estrutural do que funcional. 201 5.1.4 Estrutura cristalográfica de BlCel9 em complexo com celotriose e celoexaose revela o modo de ligação nos subsítios -2 a -7…”

“…Para esta arquitetura, foi proposto que o CD e CBM3c formam uma superfície cooperativa (os módulos ficam justapostos) para a correta acomodação e reconhecimento da fibra de celulose. 197,209,210 Coletivamente, nossas análises de SAXS para BlCel9 suportam a noção de que BlCel9 tem uma forma alongada e bem definida em solução, assemelhando-se muito a outras GH9. Entretanto, quando comparado os pHs 5 e 9, há mudanças no perfil da linha de base no gráfico de Kratky.…”

“…Funções P (r) determinadas a partir dos dados experimentais de espalhamento SAXS, e da curva de espalhamento calculada para os modelos cristalográficos de CtCbhA (PDB id 1UT9), PpGlcNase (PDB ID 5DGQ), AaCel9A (PBD ID 3GZK), CcCel9G (PDB id 1G87 ), Tf Cel9A (PDB id 1JS4) e CtCel9I (PDB id 1G87). bastante semelhante às P (r) reconstruídas a partir das estruturas cristalográficas já conhecidas para outras enzimas bi modulares tais como CcCel9G de Clostridium cellulolyticum,53 Tf Cel9A de Thermobifida fusca 45 e CtCel9I de Clostridium thermocellum 197. Em todos os casos, os parâmetros gerais derivados das análisesde Guinier e da P (r) estão em acordo.…”